山东茶叶轻稳定同位素和矿物元素特征与产地识别化学计量学分析

聂 晶 张永志 赵 明 邵圣枝 刘 志 王 钫 袁玉伟,* Karyne M.Rogers

(1 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021；2 农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021；3 青岛市农业科学研究院，山东 青岛 266100；4 新西兰GNS国家同位素中心，惠灵顿 下哈特 5040，新西兰)

茶叶起源于中国，已成为当今世界最为畅销的饮品之一，深受人们的喜爱。作为我国重要的经济农作物，茶叶种植范围广泛，种类众多，文化底蕴深厚，地域特色和品质特征明显，是典型的地理标志保护产品[1-2]。目前，国内50多个产地的茶叶品种已获批地理标志保护产品，如龙井茶、普洱茶和信阳毛尖茶等。这些地理标志产品主要分布在长江以南地区，江北地区则主要集中在山东青岛、日照、临沂和泰安等地，尤以崂山绿茶和日照绿茶最受欢迎[3]。这两地茶叶自上个世纪60年代“南茶北引”以来，经长期在沿海地带栽种培养，形成了外形粗壮、肥大，具有滋味浓厚、耐冲泡等地方特色[4-6]。

茶树是一种喜暖、喜湿、喜酸的植物[7]，受光照、气候、降雨和地理位置等因素影响，因此不同环境中，茶树中的有机组分、特征官能团、矿物元素含量或同位素比和稳定同位素比值表现出一定的地域特征。近年来，研究人员利用不同分析技术对茶叶中各种组分进行测试建立指纹图谱，并开展不同产地识别的化学计量学分析研究。利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)[8-9]、毛细管电泳[10-11](capillary electrophoresis, CE)对茶多酚类化合物和咖啡因进行了定量分析，气相色谱质谱联用(gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS)[12-13]对茶叶中的香气成分进行定性及定量检测，上述方法结合主成分分析(principal component analysis，PCA)建立产地模型，利用傅里叶红外光谱技术对茶叶中特征官能团进行扫描分析，分别用偏最小二乘(partial least squares, PLS)[14]和PCA[15]对不同产地茶叶开展产地溯源研究。元素分析-稳定同位素比率质谱(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)和电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)等检测技术以地球化学手段在茶叶溯源研究中已有研究实例，且2种方法与地理因素密切相关，不易受加工方式、气候条件等因素的影响[16]。国外已在亚洲、非洲开展了与产地相关的稳定同位素和矿物元素的茶叶品种(红茶、绿茶、花茶及乌龙茶)的研究，并取得了较好的应用成果[17-18]。稳定同位素比值(δ值)能反映生物生长环境信息及其对环境变化的适应特性，其中，δ15N能够揭示植物体施有机肥或化肥的情况[19-20]；矿物元素多与生物体所生长的环境地质息息相关[21]，栽培方式也会影响矿物元素含量的变化。将上述2种检测手段共同用于茶叶产地溯源，可有效提高判别结果的准确性和稳定性。目前，文献报道主要针对国家、省份等地理尺度较大的产品识别[22-24]，且化学计量学方法均应用于大尺度地理范围的产品判别分析，而小尺度地理范围(省内)的判别方法有待考证。

为研究山东不同产区茶叶的轻稳定同位素和矿物元素特征，采用EA-IRMS和ICP-MS测定了山东各茶叶产地(青岛崂山和胶南、日照、临沂-泰安等地区)的茶叶样品，分析相关同位素和矿物元素的测定值与产地特征影响因素，以期为地理尺度更小的茶叶产地判别和地理标志产品保护提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2013-2015年茶叶样品由青岛(崂山和胶南)、日照、临沂-泰安等地的茶叶企业提供，总样品量为137份。各产地地理位置见图1，各年份、产地样品信息如表1所示。

图1 青岛(崂山、胶南)、日照、泰安-临沂地理位置图Fig.1 Geographical map of Qingdao(Laoshan, Jiaonan), Rizhao, and Taian & Linyi

表1 茶叶样品数量及原产地Table 1 The amount of tea samples and their origin

硝酸和过氧化氢，分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；稳定同位素标准物质IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)、IAEA-600(咖啡因，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰)、IAEA-N-2(硫酸铵，δ15Nair=20.3‰±0.2‰)、IAEA-601(苯甲酸，δ18OV-SMOW=23.14‰±0.19‰)、IAEA-602(苯甲酸，δ18OV-SMOW=73.35‰±0.39‰)、IAEA-CH-7(聚乙烯，δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰)，均购自国际原子能机构(IAEA，奥地利)；B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)购自Elemental Microanalysis公司(英国)。矿物元素测定所用标准物质均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心(北京，中国)。

1.2 主要仪器与设备

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Vario PYRO cube型元素分析仪，德国Elementar公司；Isoprime100型稳定同位素比率质谱仪，英国Isoprime公司；Mars 5型微波消解仪，美国CEM公司；X-series Ⅱ型电感耦合等离子体质谱仪，美国Thermo Fisher公司;HR2864粉碎机，中国飞利浦。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 茶叶样品用粉碎机进行粉碎处理，并将粉碎完成的样品过60 目筛，避光常温保存，待测。

1.3.2 稳定同位素比值测定

1)C和N同位素：称取茶叶样品2.0～4.0 mg，放入锡箔舟中包样；按编号将包样放入元素分析仪的固体样品自动进样盘。样品中碳、氮元素在经燃烧还原后分别转化为CO2和N2，进入稳定同位素比率质谱仪进行检测。仪器具体参数：元素分析仪燃烧炉和氧化炉的温度分别为920和600℃，载气氦气，流量为250 mL·min-1。

2)H和O同位素：称取茶叶样品0.4～0.6 mg，放入银舟中包样；按编号放入元素分析仪自动固体样品进样盘中。样品中的氢、氧元素在经高温裂解分别转化为H2和CO，进入稳定同位素比率质谱仪进行检测。仪器具体参数：元素分析仪裂解炉温度为 1 450℃，氦气流量为150 mL·min-1。

3)稳定性同位素比率值：参照下列公式计算：

(1)

式中，R样品为所测样品中重同位素与轻同位素丰度之比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样品中重同位素与轻同位素丰度比。

测试数据均采用两点校正法进行处理定值，即δ13CV-PDB采用IAEA-CH-6、IAEA-600标准物质值校正，δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600标准物质值校正，δ18OV-SMOW采用IAEA-601、IAEA-602标准物质值校正，δ2HV-SMOW采用B2203、IAEA-CH-7标准物质值校正。

1.3.3 矿物元素含量及铅同位素比测定 称取0.5 g的茶叶样品于微波消解罐中，加入4.0 mL 2.0 mol·L-1硝酸和2.0 mL 30%过氧化氢，室温下预消解20 min后，拧上盖子，放入微波消解仪消解。消解完成后，冷却至室温取出内罐，将消解液转移至50 mL容量瓶并用超纯水定容，待测。同位素比测定选取同位素比率测定模式，矿物元素含量测定时用铑和铼作为内标溶液(1.00 ng·mL-1)，监控和校正仪器漂移。

1.4 数据处理及模型建立

首先采用SPSS 18.0(美国IBM公司)对数据进行单因素方差分析(one way-ANOVA)，使用两两类别比较方法对各检测元素进行数据分析处理。然后利用SIMCA-p13.0(Umetrics，德国Sartorius公司)进行偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 山东不同产地茶叶轻同位素比率特征

根据地理位置分布，崂山、胶南和日照均为沿海地区，泰安-临沂为沿海内陆地区，各地茶叶中轻同位素比率结果如表2所示。除胶南与崂山茶叶中的δ15N值具有显著差异外，其他地区的稳定同位素比值不存在显著性差异，而δ13C、δ2H和δ18O值范围变化较小，无显著差异。δ15N值的变化范围较小(2.5‰～4.0‰)，且胶南产地值最小，这可能与茶叶施氮肥方式和种类相关；δ13C值变化为-25.7‰～-24.9‰，各地差异不显著；δ2H和δ18O总体数值变化不大，变化范围分别为-66.2‰ ～ -60.4‰和24.7‰～27.3‰，δ2H和δ18O值依此递减的次序为胶南>崂山>日照>泰安-临沂产地。结合地理位置可得出，从沿海地区到内陆地区2种稳定同位素比值逐渐下降，该趋势与降水稳定同位素相同，即降水稳定同位素会随着远离海岸线而逐渐贫化，形成“大陆效应”，此类效应对大陆的沿海地区更为显著[25]。此外，对以上产地茶叶δ2H 和δ18O相关线性分析(图2)，各地的相关性良好，其中沿海地区的相关性高于沿海内陆地区。如胶南茶叶中氢氧同位素R2达到0.817 5，崂山茶叶中氢氧同位素R2为0.696 1，日照茶叶氢氧同位素R2为0.595 6，而内陆地区(临沂-泰安)R2仅为0.401 7；同时，各地氢、氧相关性的排序与同位素平均值的排序相同，即沿海地区高于沿海内陆地区。由此可见，降水对该类地区茶叶叶片同位素比值的影响具有重要意义。

表2 山东不同地区茶叶样品同位素δ值平均值与标准偏差Table 2 Mean values and standard deviations of isotope ratios oftea samples fromdifferent regions in Shandong

注：不同小写字母表示经单因素方差分析，样本间存在显著差异(P<0.05)。下同。
Note: Different lowercases represent that significance exists between inter-samples after one-way ANOVA(P< 0.05). The same as following.

注：A：崂山； B： 胶南； C：日照； D：临沂-泰安地区。Note: A: Laoshan. B: Jiaonan. C: Rizhao. D: Linyi & Taian region.图2 各地茶叶中δ2H 和δ18O相关线性分析图Fig.2 The relevance analysis of δ2H and δ18O of tea samples

2.2 山东不同产地茶叶矿物元素特征

茶叶中矿物元素受种植环境和施肥的影响，呈现一定的地域特性。针对山东产地茶叶中22种矿物元素特征进行测定并结合单因素方差分析，结果如表3所示。

根据元素含量，可大致分为痕量(<1 mg·kg-1)、微量(1～100 mg·kg-1)和常量(>100 mg·kg-1)元素3类，其中，痕量矿物元素有7种(Be、Cd、Cs、Ⅴ、Li、Co、Mo)，微量矿物元素有7种(Ga、Cr、Ni、Cu、Ba、Rb、Zn)，常量矿物元素有6种(Al、Fe、Ca、Mg、Mn、K)。此外，2个Pb同位素比(206Pb/207Pb、208Pb/206Pb)在各地的均值为1.1 ～2.1，铅(Pb)同位素作为重要的地质示踪指标，其在农产品中表现特征与地质环境密切相关[26-27]。痕量矿物元素中，崂山茶叶中Be和Cd元素显著高于日照，Cd虽是有毒元素，但其含量低于国家规定茶叶中的限值(1 mg·kg-1)[28]，对人体健康的影响可忽略；胶南茶叶中的Li元素含量与其他产地呈现显著差异。微量矿物元素中，各地差异情况不同；Cr元素含量在日照与临沂-泰安地区出现显著差异，Ni元素含量则表现在日照、临沂-泰安地区与崂山茶叶不同，Cu元素含量在青岛地区显著高于日照地区，且其在日照、临沂-泰安地区的偏差较大；Ba元素含量在临沂-泰安地区显著高于其他3个地区；Zn元素含量在日照和胶南地区表现出差异性。常量矿物元素中，崂山茶叶中的Fe和K元素含量显著高于临沂-泰安地区，Ca元素含量显著高于日照地区，而Mg元素含量显著低于胶南地区。206Pb/207Pb和208Pb/206Pb表现为临沂-泰安地区显著高于其他3个地区。综上所述，崂山产区茶叶中的某几种元素与其他一两个产地具有显著差异，但未有一个元素含量与其他3个产地茶叶都具有差异性；临沂-泰安地区处于沿海内陆，该产地与其他产地具有较大差异性,呈现空间分布上的差异特征。

2.3 山东不同产地茶叶产地计量学判别分析

PLS-DA是基于PLS回归的一种判别方式，主要反映预测变量和因变量之间的线性关系，是一种有监督的分类方法[29-30]。本研究采用4个同位素比值(δ值)与22个元素含量或元素同位素比率作为量测变量，对137份茶叶样品进行多元统计判别分析。为降低地理尺度相近对变量的影响，采用PLS-DA对日照、崂山茶叶分别与其他地区茶叶进行建模判别，以提高模型的分辨力。图3能够直观反映出样本间的相同与差异性，图3-A、B中样本基本都在95%Hotelling′s T2置信范围内，因此，模型建立的可信度较高。图3-C、D分别表示崂山和日照茶叶判别模型中各变量对第1潜变量重要性(variable important for the projection, VIP)，可量化每个量测变量对判别的贡献，VIP值越大(>1)，对产地判别的差异性越显著[29]。在崂山茶叶模型中共得出6个潜变量，拟合参数R2X为0.555，Q2为0.257；图3-A中黑色图标代表崂山地区的茶叶样本，灰色图标代表日照、胶南和泰安-临沂地区的茶叶样本，崂山茶叶基本能与山东其他产地进行区分；图3-C中有6个量测变量(206Pb/207Pb、Cd、Be、K、Co和Ni)的VIP值>1，说明以上变量在崂山茶叶与其他产地中的茶叶差异较为显著。在日照茶叶模型中共得出3个潜在变量，拟合参数R2X为0.341，Q2为0.563；图3-B中黑色图标代表日照地区的茶叶样本，灰色图标代表崂山、胶南和泰安-临沂地区的茶叶样本，可知日照茶叶与山东其他产地能有效区分；图3-D中有8个量测变量(206Pb/207Pb、Cu、Ca、Ga、Cd、Zn、Ba和208Pb/206Pb)的VIP值>1，说明以上变量在日照茶叶与其他产地中的茶叶差异达到了显著水平。

表3 山东不同地区茶叶样品矿物元素含量或同位素比值Table 3 Content of mineral elements and stable isotope ratio in tea samples fromdifferent regions in Shandong

注：表中数值为平均值±标准偏差。
Note: The value in the table means average value ± standard deviation.

进一步将训练集的137份样品作为验证集样品回验模型识别准确度，结果如表4所示。崂山茶叶模型中，崂山茶叶准确度为89.7%，其他产地茶叶的准确度为100%，总体准确度达97.8%；日照茶叶模型中，日照茶叶准确度为92.6%，其他产地茶叶的准确度为100%，总体准确度达96.4%。2个模型中其他产地茶叶的准确度为100%，表明模型的准确度较高。

注：A和 B分别为崂山与日照茶叶模型的三维空间投影坐标图；C和D分别为崂山与日照茶叶模型的第1潜变量重要性因子图。Note: A, B are for Laoshan and Rizhao tea model of projection, respectively. C and D are for Laoshan and Rizhao tea model of 1st VIP, repectively.图3 崂山与日照茶叶模型PLS-DA分析图Fig.3 PLS-DA model analysis for Laoshan and Rizhao tea samples

表4 崂山与日照茶叶PLS-DA模型判别分析结果Table 4 The OPLS-DA model statistical results for Laoshan and Rizhao tea samples

3 讨论

茶树属于典型的C3植物，在光合作用过程中参与反应的叶绿体只存在于叶肉细胞中，即光合作用的产物——碳水化合物(糖类)在叶片中生成并储存，从而能进一步被运送到茎秆合成植物自身所需的营养物质。碳水化合物中的碳、氧元素均来自二氧化碳，氢来自水。本研究结果表明，各地茶叶中δ13C值差异均未达到显著水平，δ18O与δ2H值虽差异不显著，但出现了一定的变化规律，即沿海地区高于沿海内陆地区，且δ18O与δ2H值呈现一定的线性相关性。光合作用过程中，摄取的氢参与合成有机物会发生一系列生物化学反应使得δ2H发生明显同位素分馏效应[31]，但本研究中，从空间分布看，各地茶叶中δ2H与降水稳定同位素(大陆效应)变化一致。此外，各地茶叶中δ18O值变化规律与降水稳定同位素变化一致，这与光合作用对氧同位素分馏密切相关。CO2作为光合作用重要的反应物质，首先经气孔向叶内扩散，部分被固定的CO2在与水反应生成葡萄糖的过程中，氧原子会在碳酸酐酶的催化下迅速与叶片水中的氧进行同位素交换，发生δ18O分馏，从而获得叶片水同位素信号。前人在研究大气降水与植物叶片水中发现，δ18O与δ2H值有较好的线性关系[32-33]，本研究发现沿海地区茶叶中δ18O与δ2H值也呈现一定的线性关系，且随着向内陆地区的深入，两者相关性下降。植物中的氮主要靠吸收土壤中的氮元素，在吸收、利用和同化NO3-和NH4+等无机盐的过程中会发生不同程度的氮同位素分馏，同时δ15N值也与施肥种类有关(化肥或有机肥)。袁玉伟等[19, 34]指出有机-化肥配施比例会影响黄瓜与大白菜叶片中δ15N值，并且可以通过该值判定植物在生长过程中是否使用化肥。日本研究学者[2]指出判定茶叶使用过化肥的δ15N阈值应在5‰左右；冯海强等[35]认为如果茶叶中δ15N值在7‰以下，则大多使用了化肥氮肥。本研究结果表明，崂山茶叶中δ15N与其他地区的差异达到了显著水平，因此使用化肥氮肥的可能性也较大。

植物中矿物元素主要从土壤矿物质中获得，土壤酸碱性会影响土壤中的化学反应，如土壤pH值过低或过高，常会使土壤元素有效性发生变化，从而导致不同产地的土壤中元素含量出现差异[7]。茶树属喜酸植物，酸性土壤是茶树生长所必需的生态条件之一。崂山、胶南和日照茶叶种植地区依山傍海，地貌为低山丘陵区，气候属温带季风区，地质特征主要以中酸性侵入体为基岩，岩石类型主要为花岗岩，种植土壤为棕壤土，土层较薄[4-5,21]，土壤pH值呈弱酸性，适合茶树生长。泰安-临沂地区地处山东省中部，冬季低温干燥、降水量较其他产地少，具有高山气候的自然条件，是茶树种植的次种植区[36]。因此,根据数据分析结果，沿海三地的差别可能与土壤中有机质差异、人类活动相关。

通过稳定同位素比值和各矿物元素含量或同位素比共计26个变量，分别对崂山与日照茶叶PLS-DA建立模型，验证模型中总体准确率为97.8%(崂山模型)和96.4%(日照模型)。利用该方法和模型对崂山绿茶和日照绿茶进行有效鉴别，为保护地理尺度范围较小的地理标志产品和产地溯源提供了方法学参考。同时，该模型可引入更多变量，有助于提高模型的稳定性和准确性，如气象因子等[37]。

4 结论

为挖掘山东不同产地茶叶同位素比值和矿物元素含量特征，有效区分小尺度范围产地的茶叶，利用化学计量学方法分别对日照绿茶和崂山绿茶进行建模分析。通过单因素方差分析，对山东多产地茶叶中δ13C、δ2H、δ18O 4种稳定同位素比值以及δ15N和22种矿物元素含量或同位素比进行特征机理探讨。结果显示，山东茶叶中δ13C值差异较小，δ2H、δ18O值表现出沿海地区高于沿海内陆地区的规律，且δ18O与δ2H值呈线性相关性；崂山产地的δ15N值较大，且与其他产地呈显著差异。临沂-泰安产地与崂山、胶南和日照三地地质条件不同，使得茶叶中某些矿物元素出现空间分布上的差异特征。采用PLS-DA模型有效鉴别了崂山绿茶与日照绿茶山东地理标志保护产品，该法对地理尺度更小的产品识别提供了研究思路。