甘蔗抗褐锈病基因定位亲本间多态性SSR标记筛选

单红丽 李文凤 黄应昆 王晓燕 张荣跃 李 婕 尹 炯 仓晓燕

(云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远 661699)

甘蔗褐锈病(Sugarcane brown rust)是由黑顶柄锈菌(PuccinamelanocephalaH. Sydow &P. Sydow)引起的一种流行性真菌病害，普遍存在于世界各国的甘蔗种植区[1-3]。据统计，甘蔗褐锈病可导致甘蔗减产10%～40%，蔗糖含量下降10%～36%[4]，导致一些丰产高糖品种如CP78-1247、CL41-23等被淘汰[5-6]，桂糖15号、桂糖17号、台糖86-1626、Mex105、P44、粤糖60号、德蔗03-83等面临淘汰[3,7]，以及福农41、云蔗09-1601等优良品种难以推广[8]。甘蔗褐锈病已成为影响甘蔗产业的主要病害之一。1996年Daugrois等[9]首次在甘蔗品种R570上发现抗褐锈病主效基因Bru1，随后国内外研究者进行了大量研究证实Bru1是世界甘蔗遗传基础中褐锈病抗性的主要来源[10-12]。但由于甘蔗褐锈病病原菌会随着寄主抗性基因的选择而发生突变，难以彻底消灭褐锈病。因此，不断发掘新的褐锈病抗性基因，选育持久抗性品种对延长品种抗性寿命、抑制甘蔗褐锈病流行具有重要意义。

近年来，DNA分子标记技术的迅猛发展，极大地促进了甘蔗遗传连锁图谱的构建，进一步提高了甘蔗抗病基因定位的可靠性[13]。目前，限制性片段长度多态性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)等分子标记已被广泛应用于甘蔗的研究，其中SSR标记因具有多态性高、共显性遗传、稳定性好、标记均匀分布于全基因组等优点，已成为甘蔗遗传图谱构建和抗病基因定位中最主要的标记之一[14]。如Piperidis等[15]利用SSR标记构建了Q117和MQ77-340的遗传图谱；刘新龙等[16]利用SSR标记构建了一个杂交和一个回交群体的遗传图谱；Andru等[17]利用SSR标记构建了美国路易斯安那州主栽品种LCP85-384的遗传图谱；Raboin等[18]利用SSR标记构建了R570和MQ76-53的遗传图谱，并在MQ76-53的遗传图谱上定位了1个控制红色蔗茎的基因和1个抗褐锈病的新基因；杨翠凤[19]利用SSR标记分别构建了母本GXS85-30和父本GXS87-16的分子遗传图谱，并在父母本遗传图谱上共检测到控制黑穗病性状的4个主效QTL和51个微效QTL。虽然甘蔗分子遗传连锁图谱相继被构建，但由于甘蔗是异源多倍体, 基因组血缘组成高度复杂, 染色体数量庞大，所以这些图谱的覆盖范围仍然较小, 且标记间遗传距离较大, 图谱饱和度低，因此，需要筛选更多可用于构建遗传图谱的分子标记。

褐锈病抗性通常被认为是一种具有较高遗传力的数量遗传性状[20]。高密度的遗传图谱有助于基因定位、基于图谱的基因克隆和精确分析数量性状基因，而构建高密度的遗传图谱需要大量多态性丰富的分子标记[21]。本研究选择6个高抗褐锈病不含Bru1基因的甘蔗品种(可能含有新的抗病基因)和6个高感褐锈病的甘蔗品种进行配置杂交组合，筛选在各杂交组合抗病和感病亲本间条带清晰、多态性明显、重复性较好的SSR标记，旨在提供更多遗传连锁图谱构建可用的多态性标记，以期为开展甘蔗抗褐锈病基因定位和分子标记辅助选择奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从国家甘蔗种质资源圃(云南开远)中选择6个高抗甘蔗褐锈病不含Bru1的品种(粤糖00-236、粤糖93-159、德蔗93-88、ROC24、滇蔗茅95-19、滇蔗茅95-20)和6个高感甘蔗褐锈病的品种(Mex105、ROC26、德蔗03-83、粤糖03-393、柳城03-1137、云蔗06-407)，根据感病母本×抗病父本原则选配12个杂交组合，12个组合详见表1。

1.2 基因组DNA的提取和检测

各材料分别采集充分展开的第1片新叶，按照植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术公司)说明书提取叶片总DNA，利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪(Eppendorf公司，德国)检测DNA浓度及纯度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。

1.3 SSR引物筛选

通过查阅文献及在甘蔗表达序列标签数据库(Sugarcane Expressed Sequence Tag Database)上搜索引物序列信息，最终选取前人[22-27]研究报道在甘蔗上具有较好多态性的84对SSR引物，由上海生工生物公司合成。以12个杂交组合亲本材料基因组DNA为模板，先对84对SSR引物进行初筛，选出在不同组合亲本间具有差异的引物，然后再对初筛所得引物进行复筛，最后获得各个组合亲本间条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物。

1.4 SSR-PCR扩增

PCR扩增体系为10 μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技术公司)4.5 μL，模板DNA(20 ng·μL-1)0.5 μL，上、下游引物(10.0 μmol·L-1)各0.5 μL，然后加无菌ddH2O补足至10 μL。SSR-PCR反应程序为94℃预变性4 min; 94℃变性15 s, 54℃退火15 s,72℃ 延伸1 min, 35个循环；72℃终延伸5 min，4℃保存。

1.5 扩增产物的电泳分离

扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，采用银染法进行染色，轻摇至DNA条带显示清晰，然后倒掉显色液，用蒸馏水漂洗2遍，观察记录带型并照相。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

对12份亲本材料的DNA浓度和质量进行检测，所提取DNA的OD260/OD280均介于1.7～1.9 之间。由图1可知，提取的DNA为一条清晰完整的带，条带大小一致，无蛋白质和RNA污染。说明提取的DNA完整，纯度高，符合要求。

2.2 抗性亲本间SSR标记多态性分析

84对SSR引物在12个杂交组合亲本间的多态性分析结果表明，父本相同的杂交组合亲本间多态性引物数各不同，母本相同的杂交组合亲本间多态性引物数也不同。柳城03-1137×德蔗93-88具有最多的多态性引物数，为44对，多态性比率也最高，为52.38%；Mex105×粤糖00-236的多态性引物数次之，为40对，多态性比率为47.62%；ROC26×粤糖93-159多态性引物数最少，为25对，多态性比率最低，为29.76% (表1)。

2.3 SSR 多态性标记筛选

对各组合初筛所获得的多态性引物进行复筛，由表2可知，不同亲本组合获得的多态性引物数介于6～11对，其中5-mSSCIR13、6-mSSCIR14等11对引物在德蔗03-83×滇蔗茅95-20中具有稳定多态性；18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等10对和6-mSSCIR14、14-mSSCIR27等10对引物分别在组合柳城03-1137×德蔗93-88和德蔗03-83×滇蔗茅95-19中具有稳定多态性；13-mSSCIR26、19-mSSCIR35等9对引物在Mex105×ROC24中具有稳定多态性；22-mSSCIR38、32-mSSCIR67等8对和6-mSSCIR14、40-mSSESTB06等8对和5-mSSCIR13、14-mSSCIR27等8对引物分别在组合云蔗06-407×粤糖93-159、粤糖03-393×滇蔗茅 95-19和粤糖03-393×滇蔗茅95-20中具有稳定多态性；22-mSSCIR38、25-mSSCIR48等7对，18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等7对，32-mSSCIR67、34-mSSESTA03等7对和20-mSSCIR36、27-mSSCIR53等7对引物分别在组合Mex105×粤糖00-236、德蔗03-83×粤糖93-159、粤糖03-393×ROC24和ROC26×德蔗93-88中具有稳定多态性；32-mSSCIR67、52-mSSCIR51等6对引物在ROC26×粤糖93-159中具有稳定多态性，表明这些引物可以用于后期遗传图谱的构建。

注：1～6： 6个高感褐锈病亲本材料；7～12∶6个高抗褐锈病亲本材料。Note: 1-6: 6 highly susceptible parents to sugarcane brown rust. 7-12: 6 highly resistant parents to sugarcane brown rust.图1 12份抗、感甘蔗褐锈病亲本材料基因组DNA检测结果Fig.1 Detection result of genomic DNA for 12 resistant and susceptible parents to sugarcane brown rust

表1 甘蔗抗锈病基因定位亲本间SSR多态性分析Table 1 Polymorphic SSR markers analysis between resistant and susceptible parents for localization of brown rust resistance gene

由图2和图3可知，40号以后的引物多态性较好，其中2对引物75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*不仅在多态性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中条带清晰、差异大，而且在以德蔗03-83为母本的3个组合中多态性也较好，另外在ROC26×粤糖93-159中多态性也丰富，说明这2对引物稳定性较高。

表2 亲本间多态性较好SSR标记信息Table 2 The information of good polymorphic SSR markers between resistant and susceptible parents

注：M：DNA marker (100 bp ladder)；46～84：在亲本柳城03-1137×德蔗93-88间初筛出的多态性引物编号。箭头所指为双亲差异明显的带。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 46-84: The polymorphic SSR primers number in Liucheng 03-1137 × Dezhe 93-88. The arrows point out different bands between parents.图2 24对SSR引物在亲本柳城03-1137×德蔗93-88间复筛的电泳图Fig.2 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Liucheng 03-1137×Dezhe 93-88

注：M： DNA marker (100 bp ladder)；39～78：在亲本德蔗03-83×滇蔗茅95-19间初筛出的多态性引物编号。箭头所指为双亲差异明显的带。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 39-78: The polymorphic SSR primers number in Dezhe 03-83 × Dianzhemao 95-19. The arrows point out different bands between parents.图3 24对SSR引物在亲本德蔗03-83×滇蔗茅95-19间复筛的电泳图Fig.3 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Dezhe 03-83× Dianzhemao 95-19

3 讨论

甘蔗是高度异质性的异源多倍体植物，其染色体数量较大(2n=100～130)，且遗传距离也较大(18 000 cM)[28]，遗传基础复杂，因此构建饱和图谱是有效定位主要基因的基础。Asnaghi等[29]利用R570的精细遗传图谱定位了甘蔗抗褐锈病主效基因Bru1。在构建精密的遗传图谱前首先要确定亲本组合，若亲本材料选取不当，会影响图谱的构建以及准确性[30]。Racedo等[10]、李文凤等[31]和Li等[12, 32]利用与Bru1紧密连锁的R12H16和9020-F4标记对甘蔗种质、品种和育种材料进行褐锈病抗性的鉴定和评价，发现一些表型抗病但标记检测呈阴性的材料，暗示这些材料除了Bru1外还可能存在其他的抗褐锈病基因，可作为甘蔗褐锈病潜在替代抗性来源。本研究选择了6个高抗褐锈病不含Bru1基因的甘蔗品种(可能含有新的抗病基因)为父本，与6个高感褐锈病的甘蔗品种配置12个杂交组合，利用84对SSR引物进行了抗病和感病亲本之间的多态性分析。结果发现组合柳城03-1137×德蔗93-88和组合Mex105×粤糖00-236亲本间多态性引物最多，分别为44对和40对，多态性比率最高，分别为52.38%和47.62%。表明以柳城03-1137×德蔗93-88、Mex105×粤糖00-236为亲本材料构建作图群体，更有利于利用分子标记对控制甘蔗褐锈病抗性数量性状位点进行精细定位和目标基因的图位克隆。

研究表明，构建遗传图谱的过程中，用于构建图谱的标记越多，图谱越密，准确性越高，更有利于进行抗病基因精细定位和图位克隆[33]。如Yang等[34]从 6 149 对SSR引物中筛选出了1 095对与高粱具有一致性的引物，进一步研究发现其中96对引物能用于甘蔗高密度遗传图谱构建和黄锈病抗性数量性状定位。杨翠凤[19]从80对SSR引物中筛选出了50对多态性稳定、条带清晰的标记用于割手密高密度遗传图谱的构建和黑穗病抗性QTL定位。本研究以筛选出扩增条带清晰、多态性明显、重复性好的引物为目标，对各个组合初筛获得的多态性SSR引物进行了复筛，在多态性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中获得了 18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*共10对具有稳定多态性引物，在Mex105×粤糖00-236中获得了22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*共7对具有稳定多态性引物。因此，用筛选得到的10对多态性引物用于柳城03-1137×德蔗93-88为亲本材料的作图群体，7对多态性引物用于Mex105 ×粤糖00-236为亲本材料的作图群体，将更有利于构建分子遗传图谱。

4 结论

本研究结果表明，在6个高抗甘蔗褐锈病品种和6个高感甘蔗褐锈病品种为亲本组成的12个杂交组合中，组合柳城03-1137×德蔗93-88多态性引物数最多，多态性比率最高；其次是组合Mex105×粤糖00-236。从84对SSR引物中筛选到10对(18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*)在组合柳城03-1137×德蔗93-88亲本间多态性最好的引物，7对(22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*)在Mex105×粤糖00-236亲本间多态性最好的引物，下一步可分别用于2个组合的作图群体。筛选出的亲本间多态性SSR引物将有助于甘蔗抗褐锈病新基因分子标记定位。本研究结果为后续抗褐锈病新基因定位和开发与其紧密连锁的分子标记奠定了一定的理论基础。