低糖姜脯加工过程对甲基硫菌灵和多菌灵残留的影响

蒋黎艳 黄志强 张祖姣 谢 婕 赵其阳

(1 湖南科技学院，湖南 永州 425199；2 中国农业科学院柑桔研究所/农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400712；3 德州市农业科学研究院，山东 德州 253015)

农药是农业上用于防治病虫害及调节植物生长的化学或生物制剂，全年可用，能够提高农作物质量和产量[1-2]。但农药的广泛使用导致农作物和食品中会有不同程度的农药残留甚至超标现象，对人体健康产生有害影响[3-4]。食品中农药残留问题不仅引起消费者的极大关注，也是国际食品贸易中面临的一个主要问题，是影响食品安全的重要因素之一。

食品加工是将易腐烂或未经加工的食品转变为价值更高的产品并使该产品具有更长的保质期和更好的品质的过程[1,5]。大量研究表明，不同加工方式对农药残留会产生不同的影响，在典型加工方式如清洗和煮沸[6]、去皮[7]、烹饪[8]和发酵[9-10]等的作用下，农药通常会发生一定的挥发、分解或者代谢等，从而使得加工品中的残留量降低；但某些加工处理如干燥[11-12]、浓缩和榨油[13]等，则可能导致农药残留量因富集效应而有所上升。Watanabe等[14]研究表明加工和烹饪对大米样品中呋虫胺残留水平均有一定的降低作用，熟米饭中呋虫胺的加工因子约为0.4。Oliva等[15]对西葫芦冷冻过程中的3种杀虫剂和3种杀菌剂的消散情况进行了研究，发现冷冻产品和新鲜产品中所有农药的加工因子均小于1，在冷冻产品的各个加工工序中，洗涤和漂烫处理能够有效降低农药残留量。因此，通过研究食品加工过程中农药残留的消解动态，不仅为优化加工工艺提供依据，还可为食品安全的风险评估提供参考。

生姜属姜科，富含姜油酮、姜油酚、蛋白质、脂肪、糖类、维生素和多种微量元素等，是一种历史悠久的药食兼用植物[16-18]。研究表明，生姜具有祛寒、助消化、止吐和开痰的作用[19-20]，还有抗衰老、降血脂、促进血液循环、抑制癌细胞活性以及降低癌毒害作用等多种功效[21-23]，具有极高的开发利用价值。20世纪90年代以来，随着食品加工业的快速发展，研制出越来越多的新型生姜加工产品。其中低糖姜脯是一种新型功能性低糖果脯，因其独特的风味、丰富的营养以及绿色保健等功能深受消费者青睐。但生姜在种植过程中常遭受多种病虫害。甲基硫菌灵和多菌灵作为广谱、高效、低毒的杀菌剂对多种作物的真菌病害均具有较好的防治效果，在生姜种植中主要用来防治姜斑点病和姜炭疽病[24-25]。研究发现，多菌灵能够干扰哺乳动物的内分泌，并影响精母细胞的减数分裂；甲基硫菌灵对皮肤有轻度的刺激和致敏作用，还可以转化为多菌灵危害人体健康[26-28]。目前对生姜中甲基硫菌灵和多菌灵的研究主要集中在检测方法和病虫害防治方面[29-30]，尚未有关于甲基硫菌灵和多菌灵在生姜及其制品中残留动态变化的研究报道。我国2016年颁布的食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》在食品分类中将姜归类于根茎类和薯芋类，但未专门对生姜制定限量标准，因此，生姜及其加工产品中的甲基硫菌灵和多菌灵的最大残留限量值(maximum residue limits，MRLs)也并无相应的规定。因此，本试验以江永香姜为试验对象，通过模拟浸泡强化甲基硫菌灵和多菌灵在生姜中的残留，研究2种农药在低糖姜脯加工过程中的残留动态变化，并计算各工序的加工因子，以期为加工工艺的改进、加工过程的安全性评价以及农药膳食暴露风险评估提供基础数据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多菌灵、甲基硫菌灵(标准品，纯度≥98%)，北京坛墨质检检测有限公司；甲醇、乙腈、甲苯和甲酸(色谱纯)，美国J.TBAKER公司；50%多菌灵可湿性粉剂、50%甲基硫菌灵可湿性粉剂，四川国光农化股份有限公司；无水硫酸钠、氯化钠和乙酸铵(优质纯)，深圳市化试科技有限公司；羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)，优质纯，国药集团化学试剂有限公司；氯化钙(优质纯)，成都市科龙化工试剂厂；柠檬酸(食品级)，河南恩苗食品有限公司；白砂糖、葡萄糖(食品级)，购于当地超市。

甲基硫菌灵和多菌灵农药标准储备液(1 000 mg·L-1)均用甲醇配制，密封后-50℃避光保存。将标准储备液用甲醇逐级稀释配制成以下系列标准溶液： 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1，并置于 -50℃ 保存。将空白基质提取物添加至一系列稀释标准溶液中，制备出0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1的基质空白溶液。

1.2 主要仪器与设备

API4000型液相色谱-串联质谱仪，美国 AB SCIEX公司；Venusll ASB C18色谱柱(3 μm，2.1 mm×100 mm)，天津博纳艾杰尔科技有限公司；MJ-BJ25B2搅拌机，广东省美的生活电器制造有限公司；JJ300型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；VORTEX型旋涡混匀器，德国IKA艾卡公司；SK5210HP型超声仪，上海科导超声仪器有限公司；K2015型多功能高速微型离心机，英国Centurion公司；RE-2000B型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Supelco12管防交叉污染真空固相萃取装置，天津博纳艾杰尔科技有限公司；DK-600电热恒温水锅，上海精宏实验设备有限公司；XC841-2型远红外鼓风烘干箱，中国吴江市新城烘箱制造厂；OBSC18固相萃取柱和PSA固相萃取柱[填料均为1 g·(6 mL)-1]，天津博纳艾杰尔科技有限公司；0.22 μm有机相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 香姜原材料采自湖南永州江永，24 h内运送至实验室，并对采集的样品进行甲基硫菌灵和多菌灵含量检测，确保样品不影响试验结果。在研究加工产品中农药残留的影响时，为保证加工产品中均有农药残留检出，需强化初级农产品中的农药残留水平[31]。根据《NY/T 788农作物中农药残留试验准则》[32]、《NY/T 3095加工农产品中农药残留试验准则》[33]、中国农药信息网上的甲基硫菌灵(登记证号：PD20092279)和多菌灵(登记证号：PD85150-35)，甲基硫菌灵和多菌灵的推荐使用剂量分别为850.3 mg·kg-1和500～1 000 mg·kg-1，在加工之前将香姜分别浸入含有甲基硫菌灵和多菌灵(5倍推荐高剂量)的水溶液中，30 min后捞出，在室内条件下对强化浸药的香姜进行风干处理。以清水浸泡香姜作为对照组，每个处理设3个平行。

1.3.2 低糖姜脯工艺流程 低糖姜脯加工工艺参考文献[34-35]，分别对加工过程中的各个环节的产物进行随机取样,均置于-20℃冰箱保存，备用。低糖姜脯工艺流程及取样点的设置如图1所示：

注：√：取样点。Note: √: Sampling point.图1 低糖姜脯加工流程及取样点设计图Fig.1 Scheme for low sugar preserved ginger processing and sampling points used

1)清洗：将生姜用自来水冲洗10 min，沥干表面水分；

2)去皮、切片：刮去生姜外层薄皮，修整并去掉柄蒂，用清水冼净并沥干表面水分后，用不锈钢刀切成约5 mm 厚的薄片；

3)烫漂：将上述姜片放入沸水中烫漂8 min，捞出后沥干表面水分；

4)硬化：在质量分数为2%的CaCl2溶液中浸泡1.5 h硬化处理，之后用清水冲洗干净并沥干姜片表面水分；

5)渗糖：将上述处理的姜片置于质量分数为30%白砂糖、20%葡萄糖、0.2%柠檬酸和0.5%CMC-Na 的糖液中，在25 kHz超声辅助条件下45℃加热，渗糖20 min；

6)一次干燥：将渗糖后的姜片60℃干燥3 h，每间隔1 h翻一次姜片，使其均匀烘干；

7)上胶衣：将一次干燥后的姜脯放入1.2% CMC-Na中浸泡30 s左右，捞出沥干表面水分；

8)二次干燥和包装：将上胶衣后的姜脯60℃干燥1.5 h，每间隔45 min翻一次姜片，使果脯表面均匀干燥。将二次干燥、冷却后的姜脯真空包装。

1.3.3 样品提取 样品前处理方法参照文献[36-37]并做适当改进。准确称取5.00 g样品于50 mL离心管中均质，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，再加入5 g氯化钠，涡旋1 min，在25 kHz下超声提取20 min，6 000 r·min-1离心5 min，取上清液于鸡心瓶中。剩余残渣重复上述提取过程一次，合并2次上清液，在40℃下，旋转蒸发浓缩至5 mL左右。

净化前用15 mL乙腈和15 mL 乙腈-甲苯(3∶1，v/v)分别预淋洗C18小柱和PSA小柱。然后将上述提取液加入C18小柱中，并用30 mL乙腈溶液洗脱，收集所有流出液。利用旋转蒸发仪在40℃条件下将流出液浓缩至近5 mL，再转移至PSA小柱中，用30 mL 乙腈-甲苯(3∶1，v/v)洗脱，收集所有流出液，用旋转蒸发仪于40℃条件下浓缩至近干，加甲醇定容至2 mL，用0.22 μm滤膜过滤，待测。

1.3.4 超高效液相色谱条件 色谱柱：Venusil ASB C18液相色谱柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)，柱温40℃，流动相组成：A(甲醇)+B(5 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸水溶液)。梯度洗脱程序：在0～1 min，A保持30%；在1～3 min，A由30%线性递增至95%，保持1 min，在0.1 min 内A恢复至 30%，并保持2 min；进样量：1 μL；流速：0.4 mL·min-1。

1.3.5 质谱条件 离子化模式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；质谱扫描方式：多反应监测模式(multi-response monitoring model，MRM)；离子源电压：5 kV；气帘气流量：25 kPa；离子源温度：500℃；辅助加热气：氮气，流量 65 kPa；雾化气GS1：50 psi；雾化气GS2：50 psi；定性与定量离子对、去簇电压(declustering potential, PD)、碰撞电压(cdlision voltage, CE)等参数见表1。

1.3.6 添加回收试验和精密度测定 准确称取5.00 g均质空白样品(香姜全果、香姜皮、香姜肉和低糖姜脯)于50 mL聚四氟乙烯离心管中，在0.01、0.10和1.00 mg·kg-13个水平下加标，每个水平重复测定5次，按1.3.3的方法进行前处理后上机测定，计算回收率和精密度。

表1 甲基硫菌灵和多菌灵的质谱条件参数Table 1 MS/MS parameters for the thiophanate-methyl and carbendazim

注：*表示定量离子对。
Note:*indicates quantification ion.

1.3.7 数据处理与分析 加工因子(processing factor, PF)是用于评价加工过程对农药残留的影响，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织将加工因子定义为加工后产品中农药残留量与初级农产品中农药残留量(或原材料中农药残留量)的比值[38]。其计算公式如下：

(1)。

试验结果由SPSS 19.0统计分析软件进行单因素方差分析。检验数据的差异性用最小显著性差异检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 甲基硫菌灵和多菌灵的质谱图

图2为浓度为100 μg·L-1香姜肉基质空白溶液中甲基硫菌灵和多菌灵的MRM定量离子对质谱图。

图2 甲基硫菌灵和多菌灵基质标准溶液的MRM 色谱图Fig.2 The mass spectrogram of thiophanate-methyl and carbendazim matrix standard

2.2 方法的线性关系与灵敏度

采用液相色谱-串联质谱法进行检测时，残留定量需要考虑基质效应(matrix effects, ME)。本试验采用溶剂和基质空白溶液分别配制0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1的甲基硫菌灵和多菌灵标准工作溶液，以各定量离子对的峰面积和对应质量浓度绘制标准曲线，通过空白基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率之比考察基质效应的强弱。由表2可知，甲基硫菌灵在不同空白基质里斜率之比介于0.67～0.78，说明具有明显的基质减弱效应；多菌灵在不同空白基质里斜率之比在0.88～0.98之间，基质效应的影响相对较小。因此，为提高定量的准确性，需要采用空白基质标准溶液来绘制标准曲线。

由表2可知，在该方法条件下，甲基硫菌灵和多菌灵在0.02～1.0 mg·L-1浓度范围内均呈现良好的线性关系，R2≥0.998 4。方法的灵敏度(检出限和定量限)分别按照S/N=3和S/N=10确定，2种农药的检出限均为0.005 mg·kg-1，定量限均为0.01 mg·kg-1，满足检测要求。

2.3 加标回收率和精密度结果分析

由表3可知，在不同空白基质中，甲基硫菌灵的平均回收率在75.5%～85.8%之间；多菌灵的平均回收率在87.6%～105.4%之间；2种农药的相对标准偏差在2.3%～8.6%之间，均小于10%。 表明该方法对不同基质样品的不同含量的甲基硫菌灵和多菌灵的测定均具有较高的回收率和精密度，满足检测要求。

2.4 低糖姜脯加工过程中甲基硫菌灵和多菌灵的残留变化

清洗是大多数加工工艺的第一步，清洗对农药残留的去除力度主要受农药自身的理化性质影响，如辛醇/水分配系数(Kow值)、溶解度、蒸汽压等，通常农药的水溶性越强越容易通过清洗去除[5,39]。在20℃时，甲基硫菌灵几乎不溶于水，多菌灵在水中的溶解度为8 mg·L-1，且2种农药的log Kow值均为1.5。由表4可知，清洗过程对多菌灵的去除率为31.1%，而对甲基硫菌灵的去除率高达62.3%，约为多菌灵的2倍；清洗对几乎不溶于水的甲基硫菌灵的去除率远大于水溶性相对较好的多菌灵，说明清洗对果蔬中的农药残留去除力度不一定和农药的水溶性成正比。去皮是去除2种农药的有效方法，去皮后的香姜切片中甲基硫菌灵和多菌灵分别减少了82.0%和72.9%，然而香姜皮中甲基硫菌灵和多菌灵含量分别高达190.7、228.0 mg·kg-1，说明2种农药主要富集在香姜的外表皮中，这可能与2种农药均是内吸性杀菌剂，水溶性低以及在施药过程中主要渗透在农作物的角质层有一定的关系[28]，通过去皮可以大大降低农药残留。因此，在使用果蔬外果皮进行产品加工时要加强对农药富集带来的安全性问题的监管。

表2 不同空白基质中的2种农药的线性方程、相关系数、基质效应、检出限和定量限Table 2 Regression equation with correlation coefficient, matrix effects (ME), LODs and LOQs for thiophanate-methyl and carbendazim in different blank matrices

漂烫的作用是破坏姜中氧化酶活性，初步稳定色泽，排除姜片组织内部的空气与异味，提高果脯的透明度和细胞组织的通透性，便于渗糖。在漂烫过程中甲基硫菌灵和多菌灵的去除率分别为36.8%和77.3%，2种农药的去除率有一定的差异，可能与烫漂温度有一定关系，其次还可能与2种农药的水溶性有关。硬化可以确保姜脯外形饱满，在这过程中甲基硫菌灵和多菌灵的残留量分别减少了47.7%和11.4%，其差异可能与农药的理化性质，如辛醇-水分配系数、水溶解度和盐溶解度等有关[40-41]。

超声辅助加热是低糖姜脯工艺流程中非常重要的一步。超声产生的冲击波破坏生姜果实细胞，形成微小的通道便于糖液的渗入，还可以让糖液分布均匀。超声辅助加热渗糖使甲基硫菌灵和多菌灵的残留量分别降低74.3%和72.2%。超声辅助加热渗糖对2种农药的去除率差别不大，可能是由于超声波具有空化效应、高辐射压和二次机械效应的特点，其产生的高压冲击波能击碎细胞颗粒，促使糖液进入姜脯颗粒内部；同时二次机械效应能增加姜脯表面扩散层的移动，促进细胞颗粒间的摩擦和搅拌，使糖液扩散进入姜脯孔隙中充分发挥对污染物的解吸作用，从而对农药残留的去除效果具有一定的强化作用[42]。

为延长低糖姜脯的保质期，60℃干燥以降低其水分含量。一次干燥后甲基硫菌灵和多菌灵的残留量分别增加了92.4%和137.4%，一方面是由于水分的蒸发，另一方面可能与农药的热稳定性、水溶性和挥发性等有关[11]。上胶衣可以防止姜脯氧化变色及粘连，上胶衣操作使甲基硫菌灵和多菌灵残留量降低了17.7%和20.3%，这可能是由于水分的增加，农药残留物被稀释，导致农药残留量降低。二次干燥使甲基硫菌灵和多菌灵的残留量分别增加了13.5%和19.0%，可能是水分流失导致的浓缩效应，但最终低糖姜脯成品中的农药残留量远低于原料果。

2.5 加工因子结果分析

由表4可知，低糖姜脯的各加工工序，甲基硫菌灵和多菌灵的加工因子(PF)均小于1。与原料果相比，经过各加工工序2种农药的残留量均有所降低。在清洗和去皮过程中，甲基硫菌灵的PF值明显低于多菌灵，表明清洗和去皮对甲基硫菌灵的去除率更高，这可能与农药本身的性质、水/脂溶性、辛醇-水分配系数等有关。此外，在渗糖过程中甲基硫菌灵和多菌灵的PF值最小，分别为0.006和0.010，这可能是因为加糖后农药残留物被稀释，据研究报道在冬枣糊加工过程中加糖工序中的吡虫啉、唑菌胺、嘧菌酯和氟虫腈也有类似的稀释作用[43]。在整个加工过程后，甲基硫菌灵和多菌灵的加工因子分别为0.010和0.023，与初始原料果相比，甲基硫菌灵减少了99.0%的含量，多菌灵减少了97.7%的含量，表明低糖姜脯加工可以显著减少原料中的农药残留。

表3 2种农药在香姜中的添加回收率及精密度(n=5)Table 3 Recoveries and precisions for the thiophanate-methyl and carbendazim in fragrant-ginger (n=5)

表4 低糖姜脯工艺流程中甲基硫菌灵和多菌灵残留及加工因子 (n=3)Table 4 The residue levels of thiophanate-methyl and carbendazim in real samples and PFs for different processing stages of low sugar preserved ginger (n=3)

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note:Different lowercase letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level.

3 讨论

大量研究表明，不同食品加工技术对农药残留的影响不同。影响农药吸收、渗透和降解程度的因素有很多，且不同种类食品影响因素也不同[1,4-5]。果蔬在食用或加工前的第一步往往是洗涤，此过程有利于冲洗表面的灰尘和农药。Bonnechère等[39]研究发现大多数农药的去除率与其水溶性、Kow和系统性能等有关，农药的水溶性越强越容易通过清洗去除。然而Yang等[44]研究发现农药水溶性和降解水平之间无相关性，农药去除率还可能与残留物质的年代有关。Saber等[45]研究发现农药的可冲洗性取决于多种因素(如农药、作物表皮的洗涤和物理化学性质等)，并不总是与水溶性或农药的Kow相关。本研究结果进一步证实了清洗对果蔬中的农药残留去除力度不一定和农药的水溶性成正相关。Valverde等[46]研究表明，哒螨灵和四溴菊酯由于高脂溶性的特点而被辣椒表皮的蜡质层快速吸收并强烈保留，通过清洗很难降低残留量。Boulaid等[47]研究发现番茄经清洗后，吡硫磷、哒螨灵和四溴菊酯的洗涤因子分别为1.1、0.9和1.2，强力洗涤番茄也没有减少农药残留量。

剥去果皮或削去某些蔬菜的外层是减少农药残留的有效方法。Liu等[28]对番茄酱加工过程中甲基硫菌灵和多菌灵的残留变化进行了评估，发现去皮可以使甲基硫菌灵残留量减少84.2%，多菌灵残留量减少87.3%，表明去皮是从番茄中去除农药残留的有效步骤。 Awasthi等[48]研究发现对芒果进行去皮处理几乎可完全去除4种不同的杀虫剂。Lentza-Rizos等[49]研究发现马铃薯经去皮处理后能够去除91%～98%氯苯胺灵。本研究结果表明，去皮后的香姜切片中2种农药的残留量分别减少了82.0%和72.9%，进一步证实去皮是减少农药残留的有效方法。

研究表明，烫漂和硬化处理对去除农药也有一定的影响。Radwan 等[40]研究了不同烹饪处理方法对蔬菜加工后残留物的去除效果，结果表明烫漂和煎炸过程可去除约100%的丙溴磷残留物。Sheikh等[50]以黄秋葵为原料，以联苯菊酯、异丙酚、硫丹为喷施剂，对黄秋葵进行清洗、洗涤、晒干等加工处理，结果表明烫漂处理后硫丹残留量降低了45.7%，联苯菊酯残留量降低了36.2%，丙溴磷残留量降低了38.90%，与自来水洗涤相比，漂烫能更有效消除农药残留。本研究在漂烫过程中甲基硫菌灵和多菌灵的去除率分别为36.8%和77.3%，进一步证实烫漂在一定程度上可降低农药残留。Chen等[41]研究了金桔在加工过程中5种有机磷农药的残留动态变化，结果表明将果实浸泡在0.1%氯化钙中2 h进行硬化处理，其果实中乐果、毒死蜱、马拉硫磷、甲硫磷和三唑磷残留量分别减少了39%、19%、35%、31%和15%，与本研究结果一致，说明硬化处理能降低农药残留。

干燥是食物保存最古老的方法，且相对简单。对于果酱和干制品的加工来说，由于水分的大量散失，往往会导致热稳定性好的农药残留水平升高[51]。Cabras等[52]研究了杏肉在日光和烘箱干燥过程中联苯三唑醇、二嗪农、伏杀硫磷、异菌脲、腐霉利的残留变化情况，发现日光和烘箱干燥均导致果实农药残留量增加了6倍，但是干果中的农药残留低于新鲜水果。TP等[53]研究发现葡萄干干燥过程中农药残留量增加，这可能与干燥期间水分的蒸发有关，与本研究结果一致。

4 结论

在低糖姜脯加工中，除2次干燥工序，其他加工工序均对甲基硫菌灵和多菌灵的残留有一定的降低作用，清洗、去皮和烫漂等加工工序是去除农药残留的有效方法。与初始原料果相比，经整个加工工艺制成的姜脯成品中甲基硫菌灵和多菌灵的残留量分别减少了99.0%和97.7%，加工因子分别为0.010和0.023，表明加工可以去除大部分农药含量。本研究采用5倍推荐高剂量浸药方式强化了生姜中甲基硫菌灵和多菌灵的初始残留量，远高于实际种植过程中的使用质量浓度，因此利用安全使用剂量下生产的生姜制作低糖姜脯，其残留量会更低。本研究有助于农药残留的膳食暴露风险评估的开展以及相关农药的最大残留限量值建立工作，同时，后续应更多关注如何优化食品加工技术，使其既能降低农药残留，又能保留食品中的营养成分，还应关注食品加工过程中农药残留的代谢转化过程。