白杨素对5-氟尿嘧啶诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的增敏机制研究*

宋秀道，毛晨梅，马锦

（1.南京中医药大学附属苏州医院，江苏 苏州 215009；2.苏州大学附属儿童医院 药剂科，江苏 苏州 215025）

白杨素是黄芩、南枣酸及木蝴蝶等中药的活性成分，也是一种广泛存在于蜂胶、蜂蜜、西番莲蓝莓及其他膳食植物提取物中的黄酮类化合物，具有多种药理作用，且不良反应小，毒性低[1]。在多种肿瘤细胞系和动物肿瘤模型中，白杨素具有抗肿瘤与化疗增敏作用[2-3]。本研究通过白杨素增强5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的诱导作用，提高5-FU 化疗的敏感性，减少5-FU 的使用量与毒副反应，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 人肝癌Bel-7402 细胞株由苏州大学生命科学学院惠赠，白杨素（纯度99%）和5-FU（纯度99%）购自北京百灵威科技有限公司，MTT 购自美国Sigma 公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒、二甲基亚砜（dimethylsurfoxide,DMSO）、胎牛血清及β-actin 单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，DMEM 培养液购自美国Gibco 公司，0.25%胰蛋白酶液购自上海闪晶生物公司，Annexin V-FITC 凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，碘化丙啶（propidium iodide,PI）染液购自美国Sigma 公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）裂解液购自上海源聚生物科技有限公司，ECL Plus 超敏发光液购自北京Solarbio 公司，山羊抗兔二抗购自美国CMCTAG 公司，B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）、Bcl-2 相关死亡启动因子（Bcl-2 associated death promoter,Bad）及半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3）抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.1.2 仪器 全自动酶标仪（550 型）和垂直电泳仪（Mini-P3）购自美国Bio-Rad 公司，MoFlo XDP型超速流式细胞分选系统购自美国Beckman Coulter公司，DYCZ-40B 型转膜仪购自北京六一仪器厂，Centrifuge 5810R 冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司，AlphaImager HP 化学发光成像系统购自美国ProteinSimple 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法检测细胞活力人肝癌Bel-7402 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基置于5%二氧化碳CO2、37℃饱和湿度条件的恒温培养箱中传代培养。取对数生长期人肝癌Bel-7402 细胞制成细胞悬液，调整细胞密度并接种于96 孔细胞培养板（1.2×104～1.5×104个/孔），于恒温培养箱中孵育24 h 后，吸出培养液，每孔加入100μl 白杨素的培养基（终浓度为100μmol/L），空白对照组不加药；培养24 h 后，吸出培养液后，加入含5-FU 终浓度为0.0、12.5、25.0 及50.0μg/ml 培养基作用48 h，每组设6 个复孔。每组依次加入白杨素终浓度为50、100、150、200 及250μmol/L 的培养基作用48 h，空白对照组不加药。继续培养48 h 后，每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4 h 后，吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，震荡10 min 以使结晶物充分溶解，测定490 nm 处吸光度（optical density,OD）值。计算各组细胞存活率：细胞存活率（%）=实验组OD/空白对照组OD×100%。实验重复3 次。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡与周期 取对数生长期人肝癌Bel-7402 细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105～2×105个/ml，接种于6 孔细胞培养板，2 ml/孔。于恒温培养箱中孵育过夜后，加入含100μmol/L 白杨素培养基（空白对照组为正常培养基）作用24 h 后，吸出培养液，每孔加入25μg/ml 5-FU作用48 h；然后用0.25%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化收集细胞，1 000 r/min 离心5 min，冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）漂洗2 遍。设立白杨素单独组（100μmol/L 白杨素）、5-FU 单独组（25μmol/L 5-FU）、白杨素联合5-FU组（100μmol/L 白杨素+25μmol/L 5-FU）。细胞凋亡检测：先加105μl 含Annexin V-FITC 的结合缓冲液重悬细胞，混匀后室温避光染色10 min，再加5μl PI 染液，室温避光染色5 min，流式细胞仪上样检测（激发波长/发射波长为488 nm/530 nm），获得细胞凋亡率，实验重复3 次。细胞周期检测：流式管内缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇，重新悬浮细胞，避光30 min，4℃条件下PBS 洗涤后以1 000 r/min 离心5 min，加入500μl PI 工作液，室温避光30 min，用流式细胞仪进行检测，获得各组细胞有关增殖周期时相的数据，实验重复3 次。

1.2.3 Western blotting 检测蛋白表达 取对数生长期人肝癌Bel-7402 细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于6 孔细胞培养板，2 ml/孔，于恒温培养箱中孵育过夜后，加入含100μmol/L 白杨素培养基（对照组为正常培养基）作用24 h 后，吸出培养液，每孔加入25μg/ml 5-FU 作用48 h；然后用0.25%胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，冷PBS 漂洗1 遍，收集细胞。收集的细胞加入1 mmol/L PMSF裂解液100μl，吹打均匀置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 离心30 min，取蛋白上清液，BCA 法检测蛋白浓度，剩余蛋白与上样缓冲液按比例混匀，沸水浴5 min，-80℃保存。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行蛋白分离，4℃条件下转至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h 后，加入一抗，4℃摇床孵育过夜。TBST 洗涤4 次，加入相应的二抗，孵育2 h 后，TBST 洗4 次，ECL 化学发光显色，成像系统照相，用Image-J 软件进行图片分析。

1.3 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 7.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或析因设计的方差分析，进一步两两比较用Turkey's 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白杨素增强5-FU 对人肝癌Bel-7402 细胞活力的抑制作用

MTT 法筛选实验显示，白杨素在0、50、100、150、200 及250μmol/L 浓度下作用肝癌BEL-7402 细胞48 h，细胞存活率分别为（100.00±0.000）%、（92.982± 5.313）%、（82.261±7.793）%、（62.423±6.082）%、（50.022±5.454）%和（42.372±4.564）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=56.724，P=0.000）；白杨素浓度为100、150、200 及250μmol/L 时肝癌BEL-7402 细胞的存活率低于空白对照组（0μmol/L 白杨素）（P＜0.05）。见图1。

将100μmol/L 白杨素预处理人肝癌Bel-7402细胞24 h 后不出现细胞活力抑制作用的剂量用于研究白杨素对5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡是否有增强作用。各组细胞存活率比较，经析因设计的方差分析，处理因素白杨素的主效应比较，差异有统计学意义（F=159.124，P=0.000）；处理因素5-FU 的主效应比较，差异有统计学意义（F=81.933，P=0.000）；两者交互作用比较，差异无统计学意义（F=2.768，P=0.0756）。无论是否进行白杨素预处理，人肝癌Bel-7402 细胞活力随5-FU 浓度增加而降低。100μmol/L 白杨素预处理24 h 能增强5-FU 对人肝癌Bel-7402 细胞活力的抑制作用。见表1和图2。

图1 不同浓度白杨素作用人肝癌Bel-7402 细胞48 h 后的细胞活力 （±s）

表1 两组不同浓度人肝癌Bel-7402 细胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

表1 两组不同浓度人肝癌Bel-7402 细胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

注：①与0.0μg/ml 5-FU 比较，P ＜0.05；②与空白对照组比较，P ＜0.05。

组别 0.0μg/ml 5-FU 12.5μg/ml 5-FU 25.0μg/ml 5-FU 50.0μg/ml 5-FU空白对照组 100.000±0.000 88.983±1.414 71.442±2.014① 50.224±5.323①100μmol/L 白杨素组 90.694±4.426 71.644±3.816①② 47.116±6.117①② 34.214±7.637①②

图2 两组不同浓度5-FU 作用人肝癌Bel-7402 细胞的 存活率比较 （±s）

2.2 白杨素增强5-FU 对人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的诱导作用

空白对照组细胞凋亡率为（4.15±0.88）%、白杨素单独组为（13.32±1.33）%、5-FU 单独组为（22.98±4.32）%，白杨素联合5-FU组为（45.22±5.65）%。各组细胞凋亡率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=70.234，P=0.000）；5-FU 单独组细胞凋亡率较空白对照组高（P＜0.05）；白杨素单独组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；白杨素联合5-FU组细胞凋亡率较5-FU 单独组和白杨素单独组高（P＜0.05）。100μmol/L 白杨素预处理24 h 可增强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的作用。见 图3、4。

2.3 白杨素增强5-FU 对人肝癌Bel-7402 细胞G2/M 期阻滞的诱导作用

图3 各组流式细胞仪检测结果

图4 各组细胞凋亡率比较 （±s）

用PI 单染法检测人肝癌Bel-7402 细胞周期分布情况，空白对照组[G0/G1 期：（85.35±2.61）%，G2/M 期：（3.66±0.68）%]；白杨素单独组[（G0/G1期：（80.92±4.34）%，G2/M 期：（8.06±1.05）%]；5-FU 单独组[（G0/G1 期：（73.54±5.49）%，G2/M 期：（12.67±2.28）%]；白杨素联合5-FU组[（G0/G1 期：（55.47±3.69）%，G2/M 期：（26.16±2.17）%]。各组人肝癌Bel-7402 细胞G0/G1 期细胞数比较，经析因设计的方差分析，处理因素白杨素主效应比较，差异有统计学意义（F=60.012，P=0.000）；处理因素5-FU 主效应比较，差异有统计学意义（F=21.881，P=0.0016）；两者交互作用比较，差异有统计学意义（F=8.042，P=0.022）。各组细胞G2/M 期细胞数比较，经析因设计的方差分析，处理因素白杨素的主效应比较，差异有统计学意义（F=192.212，P=0.000）；处理因素5-FU 的主效应比较，差异有统计学意义（F=83.693，P=0.000）；两者交互作用比较，差异有统计学意义（F=21.610，P=0.0016）。100μmol/L 白杨素预处理24 h 可增强5-FU 对人肝癌Bel-7402 细胞发生G2/M 期阻滞。见图5、6。

图5 各组人肝癌Bel-7402 细胞周期分布情况

图6 各组人肝癌Bel-7402 细胞G2/M 期的阻滞诱导作用比较 （±s）

2.4 白杨素对5-FU 处理人肝癌Bel-7402 细胞Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响

各组Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；白杨素联合5-FU组Bcl-2 蛋白相对表达量较白杨素单独组和5-FU 单独组低（P＜0.05），白杨素联合5-FU组Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达量较白杨素单独组和5-FU单独组高（P＜0.05）。Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 表达增强或减弱可能是白杨素预处理24 h 加强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡作用的机制之一。见表2和图7。

表2 各组Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达情况 （±s）

表2 各组Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达情况 （±s）

组别 Bcl-2 Bax Bad Cleaved Caspase-3空白对照组 0.924±0.13 0.632±0.072 0.142±0.011 0.363±0.032白杨素单独组 0.893±0.091 0.613±0.083 0.453±0.062 0.344±0.041 5-FU 单独组 0.284±0.032 0.921±0.11 0.62±0.051 0.652±0.053白杨素联合5-FU组 0.127±0.012 1.132±0.092 0.933±0.124 0.792±0.034 F 值 77.122 22.753 59.574 87.425 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图7 各组Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达量比较 （±s）

3 讨论

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界发病率较高的恶性肿瘤之一，位于癌症相关致死率的第2 位[4]。早期HCC 患者治疗以手术切除和肝脏移植辅以化疗为主，一般可取得满意疗效；但对于手术后复发、晚期有转移及不能耐受手术的患者，化疗已成为其治疗主要手段[5]。5-FU 是临床用于肝癌化疗的一线药物。在过去的20年中，5-FU 临床疗效肯定，但长期大剂量使用5-FU 产生的不良反应和耐药性已影响其临床疗效，阻碍其进一步应 用[6-7]。因此，目前迫切的任务是寻找新的化合物来增强其化疗敏感性，为临床解决肿瘤耐药性提供治疗 方案。

诱导恶性肿瘤细胞凋亡是现代癌症治疗的主要目标之一。5-FU 等化疗药物发挥化疗药物毒性的最初作用形式是诱导肿瘤细胞发生凋亡，而细胞凋亡途径异常是5-FU 发生耐药的重要机制之一[8]。一般在临床肿瘤化疗中，为克服耐药对化疗效果的影响，提倡联合用药。流行病学研究证明，大量黄酮类化合物的摄入会降低多种肿瘤的发生风险[9-10]。黄酮类化合物因而被认为可用于肿瘤预防或临床与化疗药物联合应用。白杨素作为一种具有良好临床应用前景的天然黄酮类化合物，已被证实可直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[11]。近年来研究也报道，白杨素可与阿霉素[12]、顺铂[13]等不同化疗药物协同诱导肿瘤细胞凋亡与抑制肿瘤细胞增殖。本实验结果显示，100μmol/L 白杨素预处理24 h，人肝癌Bel-7402 细胞活力、凋亡和周期分布情况未受到影响。该浓度下的白杨素预处理24 h 可增强5-FU 抑制人肝癌Bel-7402细胞活力的作用，且100μmol/L 白杨素预处理人肝癌Bel-7402 细 胞24 h 后与12.5 和25.0μg/ml 5-FU联用，人肝癌Bel-7402 细胞活力抑制效果分别优于25 和50μg/ml 5-FU 单用，表明白杨素与5-FU 联用的体外抑制人肝癌Bel-7402 细胞活力具有协同效应。100μmol/L 白杨素预处理24 h 可增强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的作用。细胞周期G2/M 期转换在细胞周期进展及凋亡启动中起重要作用。本实验结果表明，100μmol/L 白杨素预处理24 h 可增强5-FU诱导人肝癌Bel-7402 细胞G2/M 期阻滞的作用，影响DNA 复制，使癌细胞分裂受阻，从而抑制细胞增殖。因此，白杨素可提高化疗药物5-FU 促进肝癌细胞凋亡的作用，具有作为化疗增敏剂的应用前景。

目前细胞凋亡因启动阶段的不同可分为内源性线粒体通路和外源性死亡受体通路。Bcl-2家族基因是线粒体凋亡途径的重要调控因子，通过调控线粒体膜的通透性，促进线粒体释放细胞色素C 到胞质，启动Caspase 级联反应，如激活下游的凋亡效应因子Caspase-3，从而诱导细胞发生凋亡[14-15]。Bcl-2 高表达时，Bcl-2 可与Bax 形成异源二聚体，抑制细胞凋亡；Bax 或Bad 高表达时，细胞对死亡信号敏感可促发细胞凋亡过程。肝癌发生、发展过程中Bcl-2家族抑凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax与Bad等表达异常，从而打破体内凋亡/抗凋亡的平衡，抑制多种化疗药物诱导的细胞凋亡，与肝癌对化疗的耐药发生有关[16]。本实验结果显示，100μmol/L 白杨素预处理24 h 可使5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞Cleaved Caspase-3、Bax 及Bad 蛋白表达水平上调，人肝癌Bcl-2 蛋白表达水平下调，表明白杨素预处理后，5-FU 诱导的人肝癌Bel-7402 细胞线粒体凋亡途径更为活跃，促进细胞凋亡。白杨素对5-FU 诱导Bel-7402 细胞凋亡的增敏作用是否还与外源性死亡受体通路有关，有待进一步研究。

综上所述，白杨素可增强5-FU 抑制人肝癌Bel-7402 细胞活力和诱导细胞凋亡的作用，下调Bcl-2 蛋白表达与上调Bax 和Bad 蛋白表达使线粒体凋亡通路激活可能是其重要的分子机制之一。白杨素对Bcl-2家族表达水平的调控是否与核转录因子（NF-κB）、非编码RNA（microRNA）等有关，值得进一步研究。此外，笔者也将进一步研究白杨素是否能影响人肝癌Bel-7402 细胞对5-FU 的化疗敏感性。