姜黄素对阿尔茨海默病小鼠的治疗作用

孙冬梅

(长春医学高等专科学校基础医学部组胚教研室，吉林 长春 130031)

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关的神经系统原发性退行性病变，也是一种神经毒性损伤病变〔1,2〕。临床主要表现为进行性精神状态衰变，包括记忆障碍、情感障碍、认知障碍及社交障碍等，发病近年呈上升趋势〔3,4〕。目前西医对AD尚无有效治疗药物且西药长期服用副作用显著〔1，5〕，因此本实验研究采用姜黄素治疗，探究姜黄素对AD小鼠记忆能力、脑组织神经细胞损伤程度、凋亡程度、脑组织中β-淀粉样(Aβ)和磷酸化tau(Ptau)蛋白的阳性表达强度及mRNA水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物来源及分组 实验动物野生C57BL/6和转基因APP/V717雌性小鼠，体质量(23.4±1.2)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，合格证SCXK(辽)2015-0001。实验分为对照组(C57BL/6野生雌性小鼠，n=10)、AD模型组(APP/V717转基因雌性小鼠，n=10)和姜黄素治疗组(APP/V717转基因雌性小鼠，n=10)，三组均给予正常饮食。

1.2实验试剂及仪器设备 姜黄素购于上海远慕生物科技公司；鼠抗Aβ和Ptau蛋白抗体购于Abcam公司；SP9710和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司；Tunnel荧光凋亡试剂盒购于长春鼎国生物有限公司；Trizol购于Invitrogen公司；Taq酶、DL 2000 marker和RT-PCR反转录试剂盒购于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。实时荧光定量PCR仪(ABI7300，Biotek公司，美国)；Biometra PCR扩增仪(Biotek公司，美国)；Morris水迷宫(Panlab公司，西班牙)；OLYMPUS BX51和BX53显微镜(OLYMPUS公司，日本)。

1.3给药方式和剂量 对照组和模型组每天灌胃一次生理盐水0.1 ml，姜黄素治疗组每天灌胃一次姜黄素0.1 ml(50 mg/kg)，共治疗8 w。

1.4实验标本采集和检测指标

1.4.1各组小鼠记忆能力 在实验结束前5 d，通过Morris水迷宫连续训练4 d，第5天测试潜伏期，观察小鼠记忆能力是否有改善。

1.4.2各组小鼠脑组织神经细胞损伤程度 三组小鼠在治疗12 w结束后，处死取脑组织，常规石蜡包埋，制备3.5 μm切片4张，一张通过苏木素-伊红(HE)染色普通光学显微镜下观察脑组织神经细胞损伤程度及摄取图片。

1.4.3各组小鼠脑组织神经细胞凋亡程度 3.5 μm石蜡切片一张，通过Tunnel染色荧光显微镜下观察脑组织神经细胞凋亡程度及摄取图片，连续观察200倍5个视野，计数神经细胞凋亡百分率。

1.4.4各组小鼠脑组织中Aβ和Ptau mRNA水平 Trizol提取脑组织总RNA，每个样本基因扩增3次，行实时荧光定量PCR检测Aβ和Ptau mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.4.5各组小鼠脑组织中Aβ和Ptau蛋白阳性表达强度 3.5 μm石蜡切片两张，分别通过免疫组织化学染色观察Aβ和Ptau蛋白阳性表达强度，阳性表达呈棕黄色斑块，细胞核用苏木精复染为蓝色。通过连续观察200倍5个视野，计数阳性斑块。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组Morris水迷宫测试潜伏期比较 与对照组比较，模型组潜伏期明显延长(P<0.05)；姜黄素治疗组潜伏期略延长(P>0.05)，但较模型组明显缩短(P<0.05)，见表1。

2.2各组脑组织神经细胞损伤程度比较 HE染色可见对照组小鼠脑组织无神经胞损伤，姜黄素治疗组小鼠脑组织神经细胞固缩坏死较模型组明显减轻，见图1。

2.3各组脑组织神经细胞凋亡程度比较 Tunnel染色可见姜黄素治疗组小鼠脑组织神经细胞凋亡数量较模型组明显减少，较对照组略有增多；通过连续观察200倍5个视野，计数凋亡细胞百分率差异均有统计学意义(均P<0.05)；见图2，表1。

表1 各组Morris水迷宫潜伏期、脑组织中神经细胞凋亡百分率及Aβ和Ptau蛋白阳性斑块数比较

与对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

图1 各组脑组织病理学观察(HE，×200)

图2 各组脑组织Tunnel染色(×200)

2.4各组脑组织Aβ和Ptau mRNA水平比较 实时荧光定量PCR检测可见姜黄素治疗组小鼠脑组织中Aβ mRNA(9.38±2.24)和Ptau mRNA(7.53±2.39)水平均较模型组Aβ mRNA(27.56±6.19)和Ptau mRNA(16.86±6.47)明显降低，较对照组Aβ mRNA(3.12±0.98)和Patu mRNA(2.09±0.82)略有增多,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.5各组脑组织中Aβ和Ptau蛋白阳性表达强度比较 免疫组织化学染色可见姜黄素治疗组小鼠脑组织中Aβ和Ptau蛋白阳性表达强度均较模型组明显降低，较对照组略有增多；通过连续观察200倍5个视野，计数阳性斑块差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3，表1。

图3 各组脑组织Aβ、Ptau蛋白免疫组织化学染色(DAB，×200)

3 讨 论

随着社会进步人口老龄化、生活压力及日常不良生活习惯的增加，AD死亡率和发病率都在逐年的上升〔6,7〕。姜黄素是从草本植物姜黄根茎中提取出的一种多酚类化合物，以往研究表明姜黄素具有较好的生理活性，能够降血脂、抗炎、抗肿瘤、清除自由基及在痴呆领域里有着潜在意义〔2，8〕。本实验结果表明姜黄素在提高AD小鼠空间学习记忆能力方面作用显著。

AD的病理基础是Aβ在脑组织神经元细胞外的异常沉积和tau蛋白Ptau增多引起的神经纤维缠结〔9,10〕。Aβ和Tau蛋白的异常，尤其是Tau蛋白的异常与AD发病机制紧密相关〔11〕。Aβ是一种神经毒性物质，它可引起氧化应激，刺激脑组织产生4-羟基壬烯酸和过氧化氢(H2O2)，导致神经细胞凋亡；Aβ的沉积会形成老年斑，老年斑中的大量铜、铁等金属离子与Aβ作用又产生H2O2，进一步介导AD患者脑组织的氧化损伤〔12〕。Tau蛋白在神经退行性病变的诱导中最为关键，它与细胞有丝分裂、细胞内物质转运有关，是一种微管相关蛋白，通常以磷酸化和去磷酸化两种形式存在，二者保持平衡状态〔3，13～15〕；Tau蛋白位于17染色体长臂，是一种磷酸基蛋白，通常含有2～3个磷酸基，当Tau蛋白异常过度磷酸化时常含有5～9个磷酸基，丧失刺激微管聚集的生物学功能成为毒性分子，这些过度磷酸化的Tau蛋白破坏正常微管系统，自身聚集形成神经纤维缠结，引起神经元功能损伤发生脑神经退行性病变〔16,17〕。本实验结果表明姜黄素能显著提高AD小鼠空间学习记忆能力；它可能通过降低脑组织神经细胞凋亡程度及Aβ和Ptau基因水平对AD小鼠具有明显的治疗效果，其作用机制和作用通路有待于进一步探讨。