破骨细胞因子对体外培养胎鼠DRG内疼痛相关蛋白表达的影响

苗亚军，张伟伟

(1山东省立第三医院，济南250013；2山东省肿瘤防治研究院)

多种肿瘤(肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等)可发生骨转移。转移性癌性骨痛(CIBP)约占癌痛的40%。CIBP患者生活质量下降，但目前尚无有效治疗方法[1,2]。肿瘤转移性骨质破坏主要分为成骨性和溶骨性骨质破坏，其中溶骨性破坏时，激活的破骨细胞会导致骨基质释放大量的生长因子，如转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)等。初级感觉神经元位于背根神经节(DRG)，这些生长因子对初级感觉神经元的痛觉敏感性是否有影响尚不清楚。2018年1～12月，本研究采用破骨细胞因子体外培养DRG，观察DRG内疼痛相关蛋白促生激素长神经肽(Gal)、Gal受体1(GalR1)、Gal受体2(GalR2)、P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)表达的影响，为CIBP的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雌性孕鼠20只，3月龄，体质量250～300 g，购自山东大学实验动物中心，将孕鼠单独饲养，常规饮食。TGF-β1、IGF-Ⅱ、bFGF、PDGF-AA、BMP-5(美国Sigma公司)。Gal(美国Santa cruze公司)，GalR1、GalR2、SP、CGRP(美国Abcam公司)，Goat anti mouse IgG、Goat anti rabit IgG、Donkey anti goat IgG(Bioswamp公司)。

1.2 DRG摘取及培养 取孕15 d的孕鼠，用无菌10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，充分固定后，剪毛，消毒，切开皮肤、腹肌层，充分暴露盆腔。游离两侧子宫系膜，取出子宫放入装有无菌D-Hank′s缓冲液的培养瓶，冲洗2次，去除子宫及胎盘等附属物，取出胚胎，置于装有无菌D-Hank′s缓冲液的培养皿内，将培养皿置于冰盒上备用。将胎鼠置于超净工作台内，用显微镊除去其胸腹腔脏器，打开椎管，小心取出脊髓，在体视显微镜下摘取DRG，并将DRG放入盛有培养基的24孔培养板内，每孔放入3～4个神经节。取材完毕将培养板移至37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。培养基成分：92% DMEM/F-12(美国Hyclone公司)、5%FBS(美国Gibco公司)，2% 1×B-27(美国Invitrogen公司)，1%其他添加物(青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL、L-谷氨酰胺0.1 mg/mL)。培养孔板内原代培养的DRG生长至第48 h后，弃去原培养液，将DRG随机分为6组，对照组(含0.1% PBS)、TGF-β1处理组(含10 ng/mL的TGF-β1)、IGF-Ⅱ处理组(含1 μg/mL IGF-Ⅱ)、bFGF处理组(含10 ng/mL的bFGF)、PDGF-AA处理组(含50 ng/mL的PDGF-AA)、BMP-5处理组(含10 μg/mL的BMP-5)，分别加入含破骨细胞相关因子的培养液，作用24 h。

1.3 DRG内疼痛相关蛋白表达检测 采用Western blotting实验。经破骨细胞相关因子体外培养24 h，将DRG组织块取出，置于含少量PBS的EP管中，快速冲洗1次，5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，经裂解后检测蛋白浓度，每组上样量30 μg，在SDS-PAGE进行蛋白电泳，在4 ℃条件下转膜到PVDF上，TBST冲洗3次后用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，然后一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，Gal(1∶1 000)、GalR1(1∶10 000)、GalR2(1∶1 000)、SP(1∶10 000)、CGRP(1∶500)、Goat anti mouse IgG(1∶10 000)、Goat anti rabit IgG(1∶1 000)、Donkey anti goat IgG(1∶1 000)。用ECL显色全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司)进行分析，用Image J软件分析结果。以待测蛋白与相应内参的光密度比值计算蛋白相对表达量。

1.4 DRG内疼痛相关蛋白mRNA表达检测 采用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术。经破骨细胞相关因子体外培养24 h，取DRG，吸净培养液，用PBS快速冲洗1次，将DRG从培养板中夹出，移入不含RNase的EP管中。之后加入TRIzol制成匀浆后提取RNA，用cDNA逆转录试剂盒(美国TAKARA)逆转录为cDNA，逆转录程序42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。用SYBR Green qPCR master mix试剂盒(美国，KAPA Biosystems)进行RT-PCR反应，反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39个循环；65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。引物序列(南京金斯瑞生物科技有限公司):Gal上游序列5′-ACCCTGTCAGCCACTCT-3′，下游序列5′-GTCTCCCTTCCTCCACT；GalR1上游序列5′-AACTCCACAAGAAGGCT-3′，下游序列5′-CAAATACCACAACGACC-3′；GalR2上游序列5′-AAACGCAAGGTGACACGGA-3′，下游序列5′-CACAGGAGTTGGCATAGGA-3′；SP上游序列5′-GGCAACGTAGTGGTGATA-3′，下游序列5′-TGGACTGCGTAGGTGAAG-3′；CGRP上游序列5′-AAGTTCTCCCCTTTCCTG-3′，下游序列5′-GTTCCTCCTCCTGCTCCA-3′；β-actin上游序列5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，下游序列5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。

2 结果

2.1 各组破骨细胞因子对体外培养的DRG内疼痛相关蛋白表达的影响 与对照组比较，各处理组CGRP、Gal、SP蛋白相对表达量高(P均<0.05)，TGF-β1处理组、PDGF-AA处理组GalR1蛋白相对表达量低(P均<0.05)，TGF-β1处理组、bFGF处理组、PDGF-AA处理组GalR2蛋白相对表达量高(P均<0.05)。见表1。

表1 破骨细胞因子对体外培养的DRG内疼痛相关蛋白表达的影响

2.2 破骨细胞因子对体外培养的DRG内疼痛相关蛋白mRNA表达的影响 与对照组比较，各处理组Gal、CGRP mRNA相对表达量高(P均<0.05)，TGF-β1处理组、PDGF-AA处理组GalR1 mRNA相对表达量低(P均<0.05)，TGF-β1处理组、bFGF处理组、PDGF-AA处理组GalR2 mRNA相对表达量高(P均<0.05)，TGF-β1处理组、IGF-Ⅱ处理组、bFGF处理组、PDGF-AA处理组SP mRNA相对表达量高(P均<0.05)。见表2。

3 讨论

表2 破骨细胞因子对体外培养的DRG内疼痛相关蛋白mRNA表达的影响

Gal是一种广泛存在于神经系统的神经肽，主要通过G蛋白偶联受体GalR1、GalR2发挥作用。Gal及其受体在多种神经系统创伤性损伤和神经变性中发挥作用[3,4],具有神经保护作用[5,6]。肿瘤骨转移导致破骨细胞活化，相关因子大量释放。本研究结果显示，破骨细胞相关因子bFGF、TGF-β1、PDGF-AA、BMP-5和IGF-Ⅱ均可促进DRG内Gal的表达。众所周知，神经元会因周围神经损伤发生适应性改变，产生各种功能性蛋白质，以营养神经元促进神经再生。有研究证实，Gal可促进受损坐骨神经再生，并能减轻疼痛[7]。肿瘤骨转移损伤周围神经，破骨细胞相关因子可使DRG内Gal表达升高，可能是DRG对损伤的保护性反应，通过升高Gal表达发挥保护神经元的作用。有研究指出，Gal可影响痛阈。在急性炎症反应中，Gal在前扣带回神经元中可起镇痛作用[8]。在周围神经损伤后，DRG神经元中的Gal表达增加，而GalR1和GalR2表达则在神经根切断术后轻微下降[9,10]。研究证实，Gal在痛觉传导和痛觉过敏中发挥重要作用[11]。DRG神经元是初级感觉神经元，在持续外周刺激下，DRG神经元发生可塑性变化，周围神经敏感性增加，痛阈降低，产生痛觉过敏和痛觉超敏。破骨细胞相关因子可能通过升高DRG内Gal的表达来调节DRG神经元的痛觉敏感性，从而降低CIBP。

有研究指出，Gal与GalR1结合可以发挥抑制疼痛的作用[12～14]，Gal与GalR2结合与细胞的存活和凋亡密切相关[15,16]。在生理情病理况下，Gal及其受体具有很大的可塑性[17,18]。本研究中TGF-β1、PDGF-AA使GalR1表达下调，但上调了Gal和GalR2表达，bFGF促进了Gal和GalR2表达。TGF-β1、bFGF和PDGF-AA是否通过促进Gal表达发挥对DRG神经元的保护作用和疼痛调节作用，Gal是通过GalR1还是GalR2发挥上述作用，尚需进一步研究证实。总之，破骨细胞相关因子TGF-β1、bFGF和PDGF-AA使DRG神经元中Gal、GalR1、GalR2表现出一定可塑性。

SP和CGRP是周围神经系统两种重要的肽类神经递质，这两种神经肽均与伤害感受性刺激信号的传导有关，二者在DRG感觉神经元的表达或变化会受到周围伤害感受性刺激的影响[19,20]。无论在急慢性疼痛中[21]，还是在正常的疼痛或病理性疼痛中[22]，均会导致感觉神经元中SP和CGRP的释放增加。本研究中破骨细胞相关因子均可促进DRG中CGRP和SP表达，说明破骨细胞相关因子可能在CIBP中发挥作用。

综上所述，破骨细胞相关因子bFGF、TGF-β1、PDGF-AA、BMP-5和IGF-Ⅱ可促进DRG内疼痛相关蛋白Gal、SP和CGRP的表达，说明其在CIBP中发挥重要作用，其具体机制尚需进一步研究。另外本研究中TGF-β1、bFGF和PDGF-AA可使DRG神经元中Gal及GalR表现出一定的可塑性，Gal又具有神经元保护作用，但其具体作用尚需进一步研究证实。