鲟形目鱼类染色体研究现状及进展

曾庆凯，杜合军，杨 菁

( 1.三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443100；2.中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，湖北 宜昌 443100 )

染色质是真核生物遗传物质的载体，在细胞分裂过程中，核内染色质凝缩呈线状，对碱性染料较为敏感，此时称其为染色体[1]。对染色体玻片标本和染色体照片进行对比分析，并根据各染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体有无等形态特征进行观测、描述和分组，确定其染色体组型，是染色体研究的基本方式。此外，通过不同的显带方式对染色体形态结构进行对比分析，也是常用的染色体研究方法。染色体研究有助于探明生物遗传组成、遗传变异规律和发育机制，染色体研究结果对真核生物杂交育种、多倍体育种、性别遗传机理、基因组数、物种起源与进化和种族关系鉴定等具有一定的参考价值[2]。

鲟形目鱼类，隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、软骨硬鳞下纲，是一个古老的生物类群，在距今2亿年的白垩纪晚期，它们便生活在地球上，在脊椎动物遗传与进化学研究中具有重要价值[3]。鲟形目鱼类现存2科6属27种，全部分布于北半球的大型河流，咸、淡水湖泊及海水水域[4]。近年来，受到过度捕捞、偷猎、洄游受阻、产卵栖息地丧失、水质恶化、饵料匮乏等方面的影响，野生鲟形目中很多种类正濒临灭绝[5-6]。27种鲟鱼中有18种被认为是极度濒危物种，2种为濒危物种，3种为易危物种，其他为近危物种或无危物种，其中野生白鲟(Psephurusgladius)自2003年之后再未见报道[7]。因此，针对鲟形目鱼类开展各项保护和研究工作变得极为迫切。笔者主要针对鲟鱼染色体的研究概况进行介绍，以期对鲟鱼保护和研究工作起到一定的积极作用。

1 鲟鱼染色体标本制备及其染色体数目

随着细胞低渗处理技术和气干法在染色体制备中得到应用，中期分裂相细胞的获取成为了染色体标本制备的关键[8]。根据细胞获取方法的不同，染色体标本制备的方法主要有活体注射法、细胞培养法、胚胎细胞直接制片法、幼鱼游泳法等[9-12]。

鲟鱼中也有利用活体注射法制作染色体标本的报道，如短吻鲟(Acipenserbrevirostrum)[13]、施氏鲟(A.schrenckii)[14]、小体鲟(A.ruthenus)[15]、匙吻鲟(Polyodonspathula)[16]、阿姆河大拟铲鲟(Pseudoscaphirhynchuskaufmanni)[17]等。还有早年中华鲟(A.sinensis)核型分析也是采用肾细胞培养的方法完成的[18]。鲟鱼作为大型鱼类，解剖工作需要耗费大量人力物力，而作为珍稀鱼类，应避免减少其种群数目。活体注射法和内脏器官细胞培养法均需对研究对象进行解剖，目前在鲟鱼染色体标本制备中已经极少采用。鳍条、皮肤、外周血等组织样本的采集对鱼体的伤害较小，因此使用这些组织样本进行细胞培养制备染色体是比较适合的方式，现今常用的鲟鱼染色体制备方法有鳍条细胞系培养法、外周血淋巴细胞培养法等。

Fontana等[19]研究了达氏鳇(Husodauricus)、高首鲟(A.transmontanus)和西伯利亚鲟(A.baerii)鳍条成纤维细胞系的培养，获得这3种鲟鱼的鳍条成纤维细胞系。利用这些细胞系的制作染色体标本，均获得了清晰的染色体标本，分析得出西伯利亚鲟的核型为2n=246±10，达氏鳇的核型为2n=120±8，高首鲟为2n=246±10，该结果与已有的报道无显著性差异[20]。在此基础上，研究人员对小体鲟[21]、纳氏鲟(A.naccarii)[21]、欧洲大西洋鲟(A.sturio)[22]和湖鲟(A.fulvescens)[23]等进行了一系列的染色体相关研究，解析其进化关系、倍型等科学问题，以促进鲟鱼细胞遗传学的研究。

外周血淋巴细胞体外培养是一个极其复杂的过程，不同鱼类的外周血淋巴细胞对于培养条件的要求差异较大；同种鱼类随着季节、年龄、性成熟以及生理条件的不同，其淋巴细胞的培养差异巨大。Fujiwara等[24]探讨了不同培养基以及不同促淋巴细胞分裂剂对淋巴细胞有丝分裂指数的效应情况，应用于高首鲟染色体标本制备中，并获得较好的结果。Symonová等[25]在该方法基础上进行了改进，制作并获得了分散良好的杂交鲟的染色体标本。Nowruzfashkhami等[26]采用淋巴细胞培养法制作了波斯鲟(A.persicus)的染色体，分析得出其核型为2n=258±4。董颖等[27]以小体鲟为研究对象，对其外周血淋巴细胞体外增殖的培养条件也进行了探讨，为鲟鱼染色体标本制备提供技术参考。相对鳍条细胞培养而言，外周血淋巴细胞培养的优势在于花费的时间更短。

鲟形目鱼类是一种多倍体起源的鱼类，细胞水平的进化有别于其他鱼类，其染色体数目众多，形态多样。根据染色体数目可将鲟形目鱼类分为3类：染色体数目为110～130的A类，染色体数目为220～276的B类以及染色体数目约372的C类[28-29]。其染色体形态多样，包含了中着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体、端着丝粒染色体、近端着丝粒染色体以及点状的微染色体等类型，并且不同类型染色体存在较为明显的大小差异[30-31]。

开展鲟鱼染色体研究不仅对于鲟鱼分类学和系统发生研究有十分重要的意义，而且对于现代分子生物学中的基因定位、原位杂交、种间杂交鉴定和倍型研究等方面也有实际意义[32-33]。然而，由于鲟鱼染色体数目多，存在大量的微染色体，目前的研究大都只能给出染色体数目的大概范围，这使染色体研究面临极大挑战，也使鲟鱼细胞遗传学研究难以深入[34]。已报道的部分鲟鱼染色体数目统计情况见表1。

2 鲟形目鱼类染色体显带研究

染色体研究除了对其数目进行研究之外，还可通过不同的显带方式对其带型进行分析。高分辨率显带技术能显示染色体内部结构，提供更多具有鉴定性特征的信息，即显示染色体的“解剖学”特征，它被广泛应用于动、植物和人类的染色体研究领域。该方法不仅能指导同源染色体的配对和核型排列，而且能显示染色体的结构与变化。如染色体的易位、缺失、重复、臂间和臂内倒位，能正确地识别特定染色体，已成为鉴定单个染色体和染色体组、探讨物种染色体进化和系统分类等问题的方法和手段之一[32]。

表1 部分鲟形目鱼类染色体数目

根据染料及染色方法的不同，染色体显带技术包括C显带技术、Q显带技术、G显带技术、R显带技术和银染显带技术等。除此之外，荧光染料色霉素A3(CMA3)和4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)也被用于鱼类染色体显带技术，前者为GC特异性染料，后者为AT特异性染料[52]。运用不同的显带方式，鲟形目鱼类染色体研究主要包括异染色质区、核仁组织区、AT丰富区以及GC丰富区等方面。

2.1 鲟形目鱼类染色体异染色质研究

染色体异染色质主要采用C显带技术进行研究[53]。鲟形目鱼类中的西伯利亚鲟[33]、闪光鲟[38]、高首鲟[48]、俄罗斯鲟[50]、欧洲鳇[54]、小体鲟[55]等的C显带研究均有报道。从各鲟鱼的C显带结果发现，即使是最小的微染色体，C显带也可以将常染色质区和异染色质区清晰地区分开，反之也证明这些微染色体的确属于染色体，而非杂质[33]。此外，鲟鱼的C带一般只在中型染色体、小型染色体以及微染色体上出现，大型染色体上几乎未见C带，只有闪光鲟例外，其大型染色体上可检测出清晰的C带，并且出现在其短臂上，而非通常的着丝粒区域[38]。另外俄罗斯鲟的C带符合鲟鱼C带染色也表现了其特异性，即其中4个中型染色体被完全侵染，表现出完全异质性[50]。根据目前有关鲟鱼染色体异染色质的分析报道，有研究人员认为鲟鱼染色体核型进化过程符合罗伯逊融合假设，即当两条近着丝粒染色体在着丝粒或其附近某一部位发生断裂后，二者的长臂构成一个大的染色体，而其短臂构成一个小的染色体[28,56]。关于该论断的正确性有待进一步研究论证。

2.2 鲟形目鱼类染色体核仁组织区研究

核仁组织区是指核糖体基因在染色体上的分布区域，利用银染技术可以使核仁组织区特异性着色，从而分析染色体上核仁组织区的特点[57]。Fontana[3]使用银染技术比较了西伯利亚鲟、纳氏鲟、高首鲟和小体鲟的核仁组织区，发现小体鲟的核仁组织区分布在两对形态不同的同源染色体上，而其他3种鲟鱼的核仁组织区分布在两组四联体上，根据同源染色体配对原则，推断小体鲟为二倍体，其他3种鲟为四倍体。短吻鲟染色体银染显带发现10个核仁组织区，被认为是六倍体物种[13]。从以上结果推断，鲟鱼的倍型或许可界定为：A类为二倍体，B类为四倍体，C类为六倍体。推断结果的准确性还需要更多研究的支持。

有研究认为核仁组织区数目的多少可反映物种的进化程度，核仁组织区越少，其进化程度越低，更有可能为相对原始的物种[58]。基于此观点，研究人员推测含有3对核仁组织区的欧洲大西洋鲟(2n=120)相对于含有2个核仁组织区的小体鲟(2n=120)和欧洲鳇(2n=120)为较新的物种[22]。在俄罗斯鲟的染色体带型研究中，有14个核仁组织区被发现，其中4个中型染色体的核仁组织区分布在其双臂的端粒上，一个中着丝粒染色体的核仁组织区分布在长臂端粒上，4个双臂染色体和4个端着丝粒染色体的核仁组织区分布在短臂端粒上，另外还有1个大型中着丝粒染色体的核仁组织区也分布在短臂端粒上，推测俄罗斯鲟的染色体在进化过程中发生了易位重排的现象，进一步支持了鲟鱼进化的罗伯逊融合假设[50]。

2.3 鲟形目鱼类染色体GC和AT丰富区研究

CMA3和DAPI均为能与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。CMA3和DAPI分别为GC特异性染料和AT特异性染料。目前，已有多种鲟鱼采用这两种染料进行了染色体研究，比如纳氏鲟[3]、湖鲟[23]、俄罗斯鲟[50]、欧洲鳇[54]等。DAPI的染色结果显示，各种类染色体不存在特异性，而CMA3在不同染色体上表现出了不同的染色效果。在俄罗斯鲟中，大多数小型染色体的端粒区域以及亚中着丝粒染色体和中着丝粒染色体的着丝粒或者端粒区域均能检测到荧光信号；其中4个中型的中着丝粒染色体被完全染色[50]。在欧洲鳇中，大多数小型染色体都显现CMA3阳性带，大型染色体中部分近端着丝粒染色体的CMA3阳性带在近端着丝粒区域，另外还有少部分亚中着丝粒和中着丝粒的其中两条臂上也有阳性带[54]。在纳氏鲟的染色体研究中，使用CMA3对其染色体进行染色，荧光显微镜下观察发现其中一条中等大小的染色体整体都被染色，而多数小型染色体上仅部分被染色[3]。此外，CMA3还常被用于核仁组织区的研究，但是在鲟鱼的研究中发现，GC丰富区与鲟鱼核仁组织区之间似乎没有绝对的联系，因此鲟鱼中很少采用该染料研究核仁组织区[23,50]。

3 鲟形目鱼类的荧光原位杂交显带研究

荧光原位杂交技术是指细胞学方法与分子杂交技术相结合的产物，是利用荧光标记的核酸片段为探针，与中期细胞的染色体或间期细胞核的DNA杂交，在染色体上或核中显示与探针同源的DNA片段的位置，从而将这段DNA序列定位在细胞中[59]。此技术应用在染色体鉴定、异常染色体检测、某些特殊染色体在核中的位置及基因定位等研究领域。由于这项技术定位准确，应用越来越广泛，在鲟鱼染色体研究中也得到广泛应用。应用于鲟鱼荧光原位杂交技术的探针主要有：端粒、核糖体DNA (rDNA)、Hind Ⅲ卫星DNA家族等。

3.1 鲟形目鱼类端粒研究

端粒是指染色体末端所特有的帽子片段，重复序列(TTAGGG)n在所有的脊椎动物中高度保守，所有脊椎动物染色体的端粒位置都具有重复序列(TTAGGG)n[60]。通常情况下，正常的染色体均有端粒序列。欧洲大西洋鲟[22]、湖鲟[23]、小体鲟[36]、西伯利亚鲟[36]、纳氏鲟[36]、俄罗斯鲟[36]、闪光鲟[38]以及欧洲鳇[54]的染色体端粒序列研究中，所有染色体都能检测到端粒序列的荧光信号，此结果进一步说明，即使是个体极其微小的微染色体，也具有完整的染色体结构。端粒序列一般位于染色体的体臂末端，但一些特殊的物种在染色体的常染色质或异染色质中也发现端粒信号，如湖鲟[23]和俄罗斯鲟[36]都有两条染色体被端粒荧光信号完全覆盖。以下两种推断可解释该现象：其一，认为这两种鲟鱼极有可能发生了染色体重排，它们可能由其他鲟鱼进化而来；其二，这两种鲟鱼在染色体间质区域存在与端粒序列类似的重复序列，从而导致被端粒信号完全覆盖。

3.2 鲟形目鱼类核糖体DNA(rDNA)研究

真核生物的rDNA由两个高度重复的基因家族构成，分别是主rDNA基因簇(18S、5.8S和28S rDNAs)和次rDNA基因簇(5S rDNA)[33]。其中核仁组织区即为主rDNA基因簇区域，在鲟鱼染色体研究中，该区域常采用银染或rDNA探针来检测。研究发现，采用rDNA探针检测到的核仁组织区往往比银染方法要多。如欧洲鳇[54]中，通过银染发现两对中型染色体上具有核仁组织区，而28S rDNA探针检测发现6条染色体具有核仁组织区信号；欧洲大西洋鲟[22]的研究结果与其类似。根据此结果推断，银染只能使具有活性的核仁组织区显色，而28S rDNA不仅能检测银染能检测的活性区域，还能检测银染检测不到的非活性核仁组织区[21,33]。因此，使用rDNA探针研究核仁组织区相比银染能获得更全面更精确的定位结果。

rDNA在鲟鱼进化关系和染色体倍型研究中得到应用。小体鲟[21]、欧洲大西洋鲟[33]、欧洲鳇[54]这3种A类鲟鱼的5S rDNA信号为2，纳氏鲟[21]、俄罗斯鲟[33]这两种B类鲟鱼的5S rDNA信号为4。根据同源染色体配对的原则，从5S rDNA信号的数目推断A类鲟鱼属于二倍体，B类为四倍体。研究发现，短吻鲟5S rDNA的370余条染色体中出现了6个信号，研究人员认为其为6倍体，并推断短吻鲟可能是由A类鲟鱼和B类鲟鱼杂交出现的新种[51]。

3.3 鲟形目鱼类Hind Ⅲ卫星DNA家族研究

HindⅢ卫星DNA家族是串联重复的非编码DNA序列，其主要分布在染色体的异染色质区域，比如着丝粒和端粒区域[62]。有证据表明卫星DNA 与基因组的结构稳定性相关，其在进化过程中具有较高的突变率，是研究物种分类和进化关系的重要工具[63-66]。

鲟鱼相关研究中，纳氏鲟[67]中首先分离得到了Hind Ⅲ卫星DNA家族，并以此设计荧光原位杂交探针对闪光鲟[38]、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、纳氏鲟、小体鲟、欧洲大西洋鲟、高首鲟和欧洲鳇[68]的卫星DNA进行了研究，结果除了欧洲大西洋鲟外，其他鲟鱼都有清晰可见的荧光信号。推断欧洲大西洋鲟极有可能是由其他鲟鱼进化产生的物种[69-70]。

4 存在问题与展望

鲟形目鱼类染色体数量多，形态复杂，现今的染色体制备方法仍旧无法满足鲟鱼细胞遗传学的更深入研究。比如，达氏鳇的染色体数目研究存在较大的争议，早期的达氏鳇核型研究中发现其有120条染色体，而Vasil′ev等[44]研究结果表明，其染色体数目为268±4，但是DNA含量测定结果又更加支持达氏鳇染色体为120条的结果。在无法准确鉴定出染色体数目的情况下，继续深入开展细胞遗传学研究，难以评估研究结果的有效性，因此鲟形目鱼类染色体标本制备方法的研究仍旧是一个难题。

匙吻鲟鳍条细胞系建立的研究中，研究人员对第9代和第59代传代细胞进行了染色体分析，显示第9代的染色体数为2n=120，而第59代的为2n=90，说明染色体在细胞培养至59代出现了大量丢失[71]。研究人员分析了中华鲟第21代传代细胞，发现71%的细胞染色体数目均低于264，说明传至21代大部分细胞的染色体出现丢失[47]。细胞系的建立在珍稀濒危物种的保护中具有重要意义，动物细胞系在传代过程中染色体数目会发生变化，因此染色体组型的研究对细胞培养过程中遗传变异的检测具有重要作用[72]。大部分鲟鱼都处于濒危状态，进一步开展染色体研究工作，对这些鲟鱼在细胞水平的保护具有重要意义。

我国境内已知有8种鲟鱼，包括达氏鳇、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、裸腹鲟、中华鲟、达氏鲟和白鲟[73]。关于西伯利亚鲟、小体鲟、裸腹鲟的染色体研究已有较多的报道，而其他几种鲟鱼的染色体研究尚比较缺乏，为了更深入认识鲟形目鱼类的进化关系及其在脊椎动物进化中的地位，进一步开展其他几种濒危鲟鱼的染色体研究是有必要的。此外，已有研究发现人工养殖的库页岛鲟[43]和西伯利亚鲟[74]存在自发多倍体化的现象。目前对濒危鲟鱼的野生种群的补充大都采用人工养殖放流的方式，有必要对放流群体进行种质鉴定，以避免对野生种群的遗传结构造成不良的影响。