镉胁迫对食蚊鱼肝组织基因表达的影响

刘 阳，张 力，覃剑晖

( 1.铜仁学院 农林工程与规划学院，贵州 铜仁 554300； 2.铜仁市碧江区滑石乡人民政府，贵州 铜仁 554300； 3.华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070 )

近年来，随着经济的飞速发展，水环境日益遭到破坏，污染严重，各种重金属离子进入水循环，影响水生生物的的生存环境，随着生物富集作用进一步影响人类的健康[1]。重金属镉(Cd)是一种银白色有光泽的金属，有韧性和延展性，毒性强，半衰期长达10～35年[2]。目前，镉污染是当今世界所面临的一个严重的环境问题，被镉污染的空气和植物对人体危害严重，这使其受到广泛关注，在美国毒物管理委员会制定危害人类健康的名单上排名第六[3-4]。镉的来源主要有两种，一种存在于自然界中，作为副产品从硫镉矿中提炼出来，另一种来源于人类的利用，如杀菌剂、杀虫剂、油漆、颜料等排入湖、河、弃置场和农田，造成镉污染。目前镉污染已成为一个全球性的威胁[5]。

水体是鱼类赖以生存的环境，鱼类可以直接作为水体的指示生物，重金属镉主要通过两种方式进入鱼类，一种通过鳃呼吸作用，通过循环系统进入身体组织尤其是肝脏；另一种通过直接摄食方式进入体内，但食物中携带镉的含量较低，对鱼类损伤较小[6]。鱼类虽然对镉的吸收蓄积力很强，但会随水环境中镉的含量、受胁迫时间及富集部位的不同而有所差异，有国外学者研究发现，低浓度镉处理30 d，虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的游速、生长、日常氧消耗无明显变化，高浓度镉处理96 h，虹鳟的死亡率明显提高[7]。

食蚊鱼(Gambusiaaffinis)隶属于鳉形目、花鳉科、食蚊鱼属，因嗜吃蚊子幼虫而得名[8]，它又名大肚鱼、柳条鱼、大眼叮当，原产美国东南部、墨西哥及古巴，目前已经成为全球性的入侵物种之一，适应性强，生活于河沟、池塘、沼泽、水稻田等各种水体中[9],食蚊鱼因其体形小，繁殖能力强，周期短等特性符合鱼类毒性试验的要求，所以经常被应用在毒性试验中，是一种较为理想的环境污染指示生物，而目前国内对食蚊鱼在毒理学方面的研究较少。

当生物体接触镉的胁迫后，因机体保护作用，会诱导一系列抗逆相关基因的表达，对抗镉的毒性，胁迫的生物标记分子主要是金属硫蛋白(MT)、热休克蛋白(HSPs)以及细胞色素氧化酶1A(CYP1A)等[10]。笔者主要探讨了镉对食蚊鱼热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、CYP1A以及MT基因表达的影响，通过多个角度综合探讨镉对食蚊鱼的毒性作用机制以及为防治镉污染提供科学依据，拓展食蚊鱼在环境毒理科学研究中的应用范围，也为其成为模式生物提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

食蚊鱼购于上海中环花鸟市场，体质量(2.80±0.05) g，体长(4.30±0.20) cm。在实验室条件，自然光照，用曝气48 h以上的自来水暂养7 d，温度(20±2) ℃，pH 7.8±0.2。选择体色正常，游动无异常，无疾病的食蚊鱼进行试验。试验开始前24 h停止投喂，驯养开始48 h后记录死亡率，若小于5%则符合GB/T 13267—91《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》的要求。

1.2 试验试剂

总RNA提取试剂(RNAiso Plus)、反转录试剂盒(PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser)、DL 2000 DNA Maker、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自Takara公司；DEPC浓缩液购自TIANGEN公司；氯化镉、异丙醇、无水乙醇、氯仿、氯化钙等其他试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

根据急性毒性试验的结果[11]，试验以(0、1/40、1/20和1/10的96 h的半数致死质量浓度)进行染毒，镉的质量浓度分别为0、0.564、1.128、2.255 mg/L，设4个处理组，每个处理组均设3个平行，取暂养2周的健康食蚊鱼进行试验，每组放入20尾食蚊鱼，在整个试验过程中，水温(24±2) ℃，pH 7.8±0.2，光暗比12 h∶12 h，试验持续7 d，定期投喂并吸出残渣，试验期间鱼无死亡。

1.4 取样与样品处理

试验开始后的第1、3、5、7 d每组随机抽取3尾试验鱼，清洗表面，于超净工作台上进行冰上解剖，取其肝脏，置于-80 ℃冰箱中保存，以供后续HSP70、HSP90、MT、CYP1A和β-Actin基因表达的测定。

1.5 总RNA的提取

取-80 ℃冰箱中保存的样品，严格按照Takara公司RNAiso Plus试剂说明书进行操作。

1.6 逆转录反应

根据反转录试剂盒(PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser)的步骤进行操作，以上一步提取的总RNA为模板，反转录得到cDNA。

1.7 特异性引物的设计与合成

根据GenBank中已报道的HSP70(序列号KF800737)、HSP90(序列号KF800736)、MT(序列号AB455145.1)、CYP1A(序列号AB371607.1)和β-Actin(序列号KP284099.1)基因序列，按照引物设计原则，应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计食蚊鱼HSP70、 HSP90、MT、CYP1A和β-Actin基因的特异性引物(表1)，由上海生工生物公司合成。

表1 荧光定量PCR所用引物序列

1.8 荧光定量PCR

将各个样品cDNA稀释10倍作为新的模板，在实时荧光定量PCR仪上进行β-Actin和目的基因的扩增，每个样品设置3个重复。

反应体系为25 μL：依次加入SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×) 12.5 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板2 μL、dH2O 9.5 μL。

反应程序为三步法：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃退火30 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。并收集荧光信号，使β-Actin和目的基因扩增效率接近100%。

1.9 数据处理

得到的Ct数据，利用2-△△Ct法，计算目的基因的相对表达量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct0平均)-(Ctβ-Actin-Ct0平均)进行计算，其数值用平均值±标准差表示，运用SPSS 16.0统计分析软件作图，并进行单因素方差分析和Duncan′s多重比较数值的差异显著性分析[图中*、**分别表示与对照组相比差异显著(P<0.05)、差异极显著(P<0.01)]。

2 结 果

2.1 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织HSP70基因表达的影响

Cd2+对食蚊鱼肝组织HSP70基因表达的影响见图1。在1、3、7 d时，各处理组在相同时间内随Cd2+暴露质量浓度的升高，肝组织HSP70基因表达量逐渐上调，并且差异显著(P<0.01)。1.128、2.255 mg/L处理组，随着暴露时间的延长，肝组织HSP70基因表达量显著下调(P<0.01)，且趋于稳定；HSP70基因表达量峰值出现在第1 d的2.255 mg/L处理组；0.564 mg/L处理组随着暴露时间的延长，HSP70表达量无明显差异。

2.2 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织HSP90基因表达的影响

Cd2+对食蚊鱼肝组织HSP90基因表达的影响见图2。1.128、2.255 mg/L处理组随时间的延长，HSP90基因表达量总体表现为先升后降的趋势，且差异极显著(P<0.01),但0.564 mg/L处理组的HSP90基因表达水平无明显差异；在相同暴露时间下，随Cd2+暴露质量浓度的升高，HSP90基因表达水平总体表现也为显著上调(P<0.01)。

2.3 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织MT基因表达的影响

Cd2+对食蚊鱼肝组织MT基因表达的影响见图3。不同质量浓度处理组随时间延长，MT基因表达量总体表现为先升后降的趋势，且差异显著(P<0.01)；1 d和3 d时，随着Cd2+暴露质量浓度的升高，MT基因表达水平显著上调(P<0.01)，5 d和7 d时，随着Cd2+暴露质量浓度的升高，MT基因表达水平先升后降，且逐渐达到稳定(P<0.05)。

图2 Cd2+暴露对食蚊鱼肝组织HSP90基因的影响

图3 Cd2+暴露对食蚊鱼肝组织MT基因的影响

2.4 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织CYP1A基因表达的影响

Cd2+对食蚊鱼肝组织CYP1A基因表达的影响见图4。不同质量浓度处理组随时间的延长，CYP1A基因表达量总体表现为逐渐下调；1 d时，随着Cd2+暴露质量浓度的升高，CYP1A基因表达水平显著上调(P<0.01)，且达到峰值，3 d和7 d时，CYP1A基因表达水平变化不大，5 d时，CYP1A基因表达水平被显著抑制(P<0.01)。

图4 Cd2+暴露对食蚊鱼肝组织CYP1A基因的影响

3 讨 论

目前，重金属污染已经成为一个严重的环境问题，尤其是对水生生物。以往的研究表明，水体中的重金属对水生生物产生严重影响，给养殖业带来巨大损失[12-13]，特别是重金属镉，既是致癌物质，又是一种内分泌干扰物[14-15]。在本研究中，食蚊鱼经过镉处理后，利用荧光定量PCR技术检测肝组织中HSP70、HSP90、MT和CYP1A基因水平的变化情况，以了解重金属镉胁迫对食蚊鱼基因表达的影响。

3.1 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织HSP70基因表达的影响

当生物体遇到外界不良刺激，如紫外线、机械损伤、重金属、酸、氧化剂等胁迫因子时，机体为抵抗外界不良刺激生物体第一反应会合成一系列抗逆相关基因和蛋白，这些变化指标就可以作为生物化学标记，检测有机体在不利条件时的变化。在环境毒理学中，热休克蛋白经常被作为生物标志物[16]，当细胞受到很大环境压力时，它的第一反应就是合成更多的热休克蛋白[17]。本试验结果显示，随着Cd2+暴露时间的延长，食蚊鱼肝组织HSP70基因表达量先升后降，并且差异显著。黄姑鱼(Nibeaalbiflora)经过低温刺激后，随着刺激的时间增加，HSP70的表达量先增后减，直至达到稳定[18]。真鲷(Pagrosomusmajor)尾鳍纤维原细胞经镉和铜的暴露处理4 h，其体内HSP70基因水平明显增加[17]。Ryan等[16]研究表明，鱼类细胞经过镉和铜的暴露处理后，HSP70基因表达被严重诱导，HSP70基因水平在暴露结束后才恢复至正常的表达量，HSP70基因水平的变化受环境压力的影响。刘迪秋等[19]研究镉处理后对鲫鱼(Carassiusauratus)肝脏组织中基因表达时发现，其肝脏组织中HSP27、HSP47、HSP60、HSP70、HSP90、MT-B、CYP1A基因的表达属于中间型，GPx 4a、HSP30及GR基因的表达属于完全的抑制型。重金属镉胁迫唐鱼(Tanichthysalbonubes)96 h后，不同的基因表达差异显著，肝脏中HSP70基因表达水平无显著变化，而肝脏中HSP60基因表达水平受到显著诱导作用，但不同组织中的HSP70基因水平差异显著，鳃中HSP70基因水平表现为先升后降[17]。

3.2 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织HSP90基因表达的影响

食蚊鱼经过Cd2+处理后，在相同时间下，1.128、2.255 mg/L处理组HSP90基因的表达水平显著上调，并且达到峰值，而0.564 mg/L处理组HSP90基因的表达水平无明显差异。以往的研究表明，HSP90基因的表达水平在不同物种或者不同重金属暴露下差异很大。如用10 mg/L镉溶液处理鲤鱼(Cyprinuscarpio)，其肾脏中HSP90a基因表达水平先升后降，但肝脏中HSP90a表达水平却显著上升[20]。唐鱼在经过重金属镉暴露后，鳃和肝脏组织中HSP90基因的表达水平明显低于对照组，表现为下降趋势[17]。而在本研究中，重金属暴露后HSP90基因的表达被显著诱导，这与斑马鱼(Daniorerio)[21]和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[22]的研究结果相似。HSP90表达水平上升，可能是生物遇到毒物时，HSP90基因协助变性的蛋白质进行修复，保护机体。

3.3 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织MT基因表达的影响

MT是可溶性金属结合蛋白，富含较多半胱氨酸的短肽，对多种金属具有高度亲和性[23]，因此能选择性结合铜、镉、锌等金属离子。MT基因已被广泛用作重金属处理的生物标记物，尤其是镉[24]。在本试验中，所有的Cd2+处理组的食蚊鱼肝组织中的MT基因表达量与对照相比均差异显著，随着暴露的时间延长，MT基因的表达量显著上升后下降。在之前的研究中也观察到类似的现象，如镉处理后在大鼠肝组织的MT基因显著上升达到高峰，然后下降[25]，也与虹鳟[26]和罗非鱼(Oreochromis)[27]经过刺激后MT基因变化相似。一定量的重金属诱导MT基因的表达量增加，但随时间延长，重金属在肝脏中快速堆积，超过其耐受，可能破坏MT基因表达量和重金属之间的稳定。

3.4 Cd2+胁迫对食蚊鱼肝组织CYP1A基因表达的影响

CYP1A是一个典型的生物标志物，环境污染物和药物会影响其活性，目前CYP1A被广泛应用在毒理学试验中[28-29]。本研究结果表明，Cd2+胁迫初始时，CYP1A基因的表达水平较对照组显著上调，但随处理时间的增加，其表达水平又被显著抑制。Huang等[30]报道，类固醇激素处理雌性食蚊鱼，肝脏CYP1A基因的表达量显著减少。事实上，经过有毒物质处理的食蚊鱼，其CYP1A基因表达水平的抑制可以调节细胞的解毒能力。因此据本研究结果推测，Cd2+可以调节CYP1A基因表达水平，为需要监测Cd2+的区域的生物作标志物。

本试验的结果表明，镉暴露对食蚊鱼的HSP70、HSP90、MT和CYP1A基因较为敏感，这为食蚊鱼作为潜在的试验动物提供了依据，拓展了其在环境毒理学中的研究。此外，重金属暴露质量浓度和反应时间也会影响生物标记物的基因表达水平，监测过程中不能只单纯利用一个指标，综合各个指标进行评价，才能得到可靠、符合事实的结果。