北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因多态性

易金鑫，代应贵，孙际佳，张浩然，刘 丽

( 1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学，特种水产研究所，贵州 贵阳 550025； 3.华南农业大学 海洋学院，广东 广州 510642 )

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)属鲈形目、丽鲷科、罗非鱼属，分布于非洲尼罗河流域。尼罗罗非鱼自1976年作为优良品种被联合国粮农组织推广养殖以来，也是我国成功推广的鱼类引进养殖品种[1]。早在20世纪70年代末，珠江流域就开始了尼罗罗非鱼的养殖，其中部分尼罗罗非鱼个体自养殖区逃逸入侵河流并快速繁殖、扩散，在该流域建立了野生种群[2]。

外来种入侵是当今世界生物学研究的热点问题之一[3-4]。外来种入侵到新的环境，需要克服各种生物及非生物屏障。在入侵过程中，外来种种群的建立、扩张要经历自身的演变、适应、竞争和暴发[4]。大多数外来物种通过不同途径侵入新区域时，初始种群通常是由原产地的少数个体繁衍而来，其遗传多样性可能比原产地的种群要低得多[4]，但也有少部分种群能克服种群奠基者效应，在入侵地建立稳定的种群[3]。研究表明，种群丰富的遗传多样性是外来种入侵成功的重要保证[5]。

线粒体DNA结构较为简单，具有分子量小、严格遵循母系遗传等特点，从而被广泛用于种群遗传学和系统进化研究[6]。细胞色素b(Cytb)基因是mtDNA上唯一的结构和功能被了解得较为清楚的蛋白编码基因，进化速度适中，是研究群体遗传结构的理想工具，也是鱼类种群遗传多样性研究常用的标记之一[7]。

北盘江为珠江水系西江上游支流。由于受董箐电站大坝的阻隔，目前尼罗罗非鱼在北盘江仅扩散分布于董箐电站大坝以下北盘江下游河段，并已成为该河段鱼类优势种群[8-9]。迄今为止，尚未见有关北盘江下游尼罗罗非鱼野生群体遗传多样性的研究报道。笔者通过对北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因序列进行全序列测序，分析其序列变异及遗传多样性，阐述北盘江下游尼罗罗非鱼群体遗传多样性，为评估该群体对北盘江下游河段的入侵适应能力提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2016年4月于贵州北盘江董箐电站大坝以下下游河段的董箐、白层、乐元、岩架4个采样点(图1)，共采集尼罗罗非鱼38尾，体长106～252 mm，体质量47.4～576.4 g。每尾鱼在背部取其肌肉约为2～3 g，以酒精固定，并于-20 ℃下保存备用。

图1 北盘江下游尼罗罗非鱼样品采集点

1.2 Cytb基因扩增与测序

使用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取试剂盒提取尼罗罗非鱼mtDNA，并用1.00%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量和纯度。尼罗罗非鱼Cytb基因序列扩增以及测序的引物为：5′CTAATGACTTGAAAAACCACCG 3′，5′TTTGGGAGTTAGGGGTAAGGGT 3′。PCR扩增所得产物经过1.00%的琼脂糖凝胶电泳检测后，选取有良好扩增条带的PCR产物，送至上海生物工程有限公司进行纯化及双向测序。

1.3 数据处理

序列输入BioEdit和Editseq软件进行对比分析，辅以人工校对，并从GenBank获取长度相同的同源序列校对DNA序列的一致性。运用Mega 5分别计算碱基及氨基酸含量、核苷酸序列差异，采用Dnasp计算遗传多样性参数。在GenBank下载莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)Cytb基因序列为外群(登录号：AY597335.1)，根据Kimura双参数法计算单倍型遗传距离，构建尼罗罗非鱼单倍型邻接法及最大似然法系统发育树。

2 结果与分析

2.1 尼罗罗非鱼Cytb基因序列变异

通过扩增、测序，并进行同源序列比对分析，获得北盘江下游尼罗罗非鱼群体长度为1135 bp的Cytb基因序列。

尼罗罗非鱼Cytb基因序列中共计发现151个变异位点，每个变异位点分别含有1～19个试验鱼个体。这151个变异位点含116个转换位点、32个颠换位点和3个转换与颠换共存位点，转换位点数明显多于颠换位点数(表1)。其中，简约信息位点为150个，单一变异位点为1个。在151个变异位点中，分布于密码子第3位点的变异位点为最多、达134个，而分布在密码子第1、2位点的变异位点分别只有16个、1个。

表1 北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因及密码子碱基变异

2.2 尼罗罗非鱼Cytb基因编码氨基酸序列及变异

北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因1135 bp序列共编码了378个氨基酸。在这378个氨基酸组成的多肽序列中，以亮氨酸所占平均比例最高(16.33%)、色氨酸所占平均比例最低(0.41%)。该群体Cytb基因共有133个同义突变、9个非同义突变，同义突变显著多于非同义突变(表2)。在由9个非同义突变引起的氨基酸变异中，第6位氨基酸变异较多，在单倍型6、12、13由赖氨酸(AAA)变成了谷氨酸(GAA)，在单倍型5、11由赖氨酸(AAA)变成谷氨酰胺(CAA)。第364位氨基酸由异亮氨酸(ATT)变成了缬氨酸(GTT)。第365位氨基酸由亮氨酸(CTC)变成了苯丙氨酸(TTC)。这3个位点氨基酸变异均由密码子第1位点碱基突变所致。第360位氨基酸，因密码子第2位点变异，导致其由苯丙氨酸(TTC)变成了丝氨酸(TCC)。密码子第3位点突变所导致的变异发生在第125位氨基酸由异亮氨酸(ATA)变成了甲硫氨酸(ATG)以及第302、341位氨基酸由甲硫氨酸(ATG)变成异亮氨酸(ATA / ATT)。第303、320位氨基酸，因密码子第1、3位点同时突变，分别由缬氨酸(GTT)变成了异亮氨酸(ATC)、由亮氨酸(CTA)变成了异亮氨酸(ATC)。

表2 北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb氨基酸变异位点

注：HAP1～14为第1～14单倍型；E.谷氨酸，I.异亮氨酸，K.赖氨酸，L.亮氨酸，M.甲硫氨酸，P.苯丙氨酸，Q.谷氨酰胺，S.丝氨酸，V.缬氨酸.

2.3 遗传多样性及遗传距离

北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因共计发现了14个单倍型。单倍型之间的遗传距离为0.0009～0.1479，平均遗传距离为0.0781。单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数、平均核苷酸差异数分别为0.8634、0.0671、76.1679。

根据遗传距离构建了北盘江下游尼罗罗非鱼群体单倍型的邻接法(图2)、最大似然法(图3)系统发育树，两种系统树具有相似的拓扑结构。该系统树显示，北盘江下游尼罗罗非鱼群体可分为2个分支，其中一个分支包含8个单倍型共19个个体，另外一个分支含有6个单倍型19个个体。

图2 基于遗传距离构建的北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因单倍型邻接法系统发育树

图3 基于遗传距离构建的北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因单倍型最大似然法系统发育树

3 讨 论

3.1 Cytb基因序列和密码子变异

由于蛋白质功能上的需要和三联体密码子结构的限制，DNA蛋白质编码区往往很少发生碱基缺失和插入[10]。本研究中，北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因序列未出现缺失或插入，其变异表现为碱基替换：转换与颠换。在线粒体DNA进化过程中，通常认为发生转换的频率远高于发生颠换的频率[11]。北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因共发现了116个转换位点、32个颠换位点、3个转换与颠换共存位点(表1)，转换位点显著多于颠换位点。理论上，DNA碱基发生转换有4种可能，发生颠换有8种可能，其碱基转换概率与颠换概率的比值应为0.5，然而由于碱基替换不是随机发生的，以致实际上常常出现其比值大于0.5的“转换偏差”[11]。在基因组的碱基替换变异中，DNA复制酶的严谨性、变异修复酶的保真性、碱基构成及理化因素影响等都会影响碱基的变异[11]。卢松柏等[12]研究了蛋白编码基因的四倍简并位点，在排除结构和功能上选择压力对突变的影响后，仍然发现四倍简并位点存在着转换对颠换的优势。用诱变剂处理大肠杆菌(Escherichiacoli)发现，诱变处理会导致更高的转换比率[13]，由此推测转换对颠换的优势可能还与体内含有某些诱变剂有关。Meyer[14]认为，在密码子突变中以第3位点上的碱基变异最为常见，其中又以第3位点上的碱基转换为最多，其次第3位点上颠换及第1位点上的转换较多。本研究中，北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因密码子第3位点碱基转换、颠换位点分别为101个和31个，第1位点有14个转换位点和1个颠换位点，而第2位点仅有1个转换位点，这与Meyer[14]的结论一致。

北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因共有133个同义突变、9个非同义突变(表2)。其中，密码子第1位点、第3位点碱基替换导致的非同义突变数占总突变数的比例分别为5/16、5/134，第2位点碱基只发生1个碱基转换并引起了非同义突变。因此，该群体Cytb基因密码子第1位点碱基变异导致的非同义突变数占总突变数的比例最高，而第3位点虽然发生碱基变异频率最高，却多为同义突变。

3.2 遗传多样性与入侵适应潜力

在生物群体遗传多样性分析中，通常用单倍型的平均遗传距离来衡量群体中个体间的遗传变异程度，当单倍型的平均遗传距离大于0.01时，被认为群体变异程度大[15]。本研究中，尼罗罗非鱼单倍型的平均遗传距离为0.0781，由此，该群体产生了较大的遗传变异。同时，群体单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数的高低，也是评价一个生物群体遗传多样性水平的重要指标; 由于群体中mtDNA单倍型数小于群体样品总数，所以在评价群体遗传多样性时核苷酸多样性指数较单倍型多样性指数更为可靠[16]。Grant等[17]认为，如果群体核苷酸多样性指数高于0.005并且单倍型多样性指数高于0.5时，则该群体的遗传多样性较高。本研究中，北盘江下游尼罗罗非鱼群体的核苷酸多样性指数、单倍型多样性指数分别为0.0671、0.8634，表明该群体具有较高的遗传多样性。北盘江下游尼罗罗非鱼群体核苷酸多样性及单倍型多样性高于珠江水系斑鳜(Sinipercascherzeri)7个地理群体(核苷酸多样性指数0.0020，单倍型多样性指数0.7730)[15]，也高于广西奥利亚罗非鱼那马群体(核苷酸多样性指数0.0007，单倍型多样性指数0.4940)及武鸣养殖群体[18](核苷酸多样性指数0.0009，单倍型多样性指数0.6770)。北盘江尼罗罗非鱼群体单倍型多样性与Rognon等[19]研究的非洲自然种群(单倍型多样性指数0.8846)相似，但核苷酸多样性较非洲尼罗罗非鱼自然种群(核苷酸多样性指数0.0311)高。因此，北盘江下游尼罗罗非鱼群体Cytb基因具有丰富的遗传多样性。

Grant等[17]指出，群体具有较高的核苷酸多样性、较高的单倍型多样性，说明该群体是由一个大而稳定的种群经过了较长的历史演化而来或者由两个不同系群发生二次接触所致。西江上游尼罗罗非鱼野生群体源于多年来本地区引种养殖尼罗罗非鱼后逃逸至河流开放水体并自行扩散。到目前为止，北盘江尚未开展尼罗罗非鱼人工养殖，故该河流尼罗罗非鱼群体应源于西江上游红水河尼罗罗非鱼养殖逃逸群体。由于红水河尼罗罗非鱼养殖品系差异和逃逸时间不同等原因，加大了该河流尼罗罗非鱼不同群系二次接触的可能性，因而北盘江尼罗罗非鱼群体具有丰富的遗传变异。

物种遗传多样性的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关; 物种遗传多样性越丰富，其适应能力、生存能力和进化潜力就越大，遗传多样性为物种的适应能力、生存能力和进化潜力提供了潜在的遗传基础[20]。同时，遗传多样性还被认为是决定外来种能否入侵成功的重要因素之一[4]。鉴于尼罗罗非鱼在北盘江下游现已形成一定规模的野生种群[8-9]并具有丰富的种群遗传多样性，可见作为鱼类外来种尼罗罗非鱼在北盘江下游显示了较强的入侵适应潜力。

研究表明，进行群体遗传多样性研究时，为了避免因人为取样原因对遗传多样性研究结果造成影响，供试验的样本量应在30以上[21]。本研究中，北盘江尼罗罗非鱼群体采样的样本量大于30，而且沿河捕捞采样可以确保采样过程中采集样点涵盖了北盘江下游全部河段。因此，本研究中，试验分析获得的北盘江尼罗罗非鱼群体遗传多样性参数和结果可信度高。