PEG/PEI/PASP修饰的磁性氧化铁纳米粒子的制备及磁共振成像的研究

钟 良，谢松伯，夏 天，杨凤丹，聂 婉，梁广钦，张宝林

(桂林理工大学材料科学与工程学院, 广西有色金属及特色材料加工教育部重点实验室，广西光电材料与器件重点实验室，桂林 541004)

1 引 言

超顺磁性氧化铁纳米粒子(Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有良好的超顺磁性和生物相容性，被广泛地应用于磁共振成像造影剂[1-3]、靶向给药[4-5]、磁热疗[6]、快速生物分离[7]等领域的研究。针对于不同的生物应用可以对SPIONs进行表面改性和修饰，例如：Huang等[8]研制了半乳糖-终端的氨基官能化SPIONs纳米探针，该探针可与肝细胞表面的脱唾液糖蛋白受体靶向结合，经化学修饰后的SPIONs纳米探针具有肝细胞靶向作用；Liu等[9]将SPIONs与mRNA c-fos和β-actin链互补的单链脱氧核苷酸结合，得到特异性分子探针SPIONs-ODN，能在活体内监测特定mRNA的转录过程；Kumar等[10]成功合成涂有脱乙酰壳多糖的SPIONs，并与质粒DNA结合，增强了绿色荧光蛋白的表达[11]。

聚天冬氨酸(PASP)为聚氨基酸家族中的一类，是一种氨基与第二羧基形成的聚阴离子型多肽[12]，是具有比其它聚合物更稳定的较高生物相容性的聚氨基酸[13]。PASP修饰后的SPIONs在血液中的循环时间延长[14]，并提高了EPR效应(即实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect))[15]。Chen等[16]发现PASP包覆修饰有整联蛋白(RGD)和大环螯合剂(DOTA)的SPIONs可以应用于靶向肿瘤的研究，具有优异的肿瘤靶向性、相对较长的循环半衰期和减小肝脏巨噬细胞吞噬的能力，这归因于PASP的稳定性和抗干扰能力，而PASP包裹的SPIONs在应用于MRI造影剂的工作很少有人进行研究；阳月等[17]发现铜钴锡硫(CCTS)纳米晶具有核磁共振成像增强功能；Richard[18]团队制备了具有核壳结构的Fe@Fe3O4纳米材料，这种核壳结构的纳米材料有明显的造影效果。

一般用于MRI造影剂的粒子以Gd3+、Co2+、Mn2+及其配合物如钆喷酸葡甲胺盐(Gd-DTPA)为主，这些金属离子具有顺磁性，能通过缩短T1使图像变亮，为正向造影剂或T1造影剂，应用最广泛的对比剂是 Gd-DTPA。Ao 等[19]以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体，成功制备了包裹Gd-DTPA和氟碳气体的微泡造影剂，体内外实验均实现了超声与MRI 的共同显像。与顺磁性物质不同，超顺磁性材料为负向造影剂或T2造影剂，其中超顺磁性氧化铁纳米粒子是典型的T2造影剂，成分以γ-Fe2O3和Fe2O3为主。超顺磁性氧化铁材料具有以下优点：(1)磁矩大，使用剂量小；(2)Fe2+可以被人体吸收，低毒性，生物相容性高；(3)氧化铁纳米粒子容易进行表面修饰，适用于制造分子探针；(4)能在外磁力的吸引下进行靶向引导；(5)可以在交变磁场作用下产生热能，用于肿瘤的磁热治疗。孙阳等[20]成功制备了载有超顺磁性氧化铁高分子的微球，其可用于超声和MRI的共同造影。李奥等[21]成功制备了液态氟碳纳米粒(载有SPIONs)，体内外实验结果均显示超声和MRI显像可以有效增强。

高温热分解法是制备磁性氧化铁纳米粒子既简单又重要的方法之一。由于有机金属配合物的不稳定性，在加热、光照和超声等较温和的条件下，可分解为金属或者金属氧化物，因此这类有机金属配合物常常被用作制备SPIONs的前驱体[22]。通过高沸点的聚合物为溶剂，制备得到单分散性、尺寸和形貌均可控的PEG/PEI-SPIONs，在其基础上接枝PASP，对所得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs物理化学性质进行表征，并对其在小鼠脑部MRI造影效果进行研究及评价。

2 实 验

2.1 实验试剂

乙酰丙酮铁(Fe(acac)3, TCL(东京)化成工业株式会社)；聚乙二醇(PEG, Mn=1000，汕头市西陇化工有限公司)；聚乙烯亚胺(PEI, Mn=1800，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；聚天冬氨酸(PASP，成都艾科达化学试剂有限公司)；甲苯、丙酮(汕头市西陇化工有限公司)。

2.2 材料的合成与制备

取15 g PEG及0.3 g PEI添加入三颈烧瓶中，在磁力搅拌下升温至 80 ℃，称取0.7 g Fe(acac)3加入到烧瓶中，此温度下保温10 min，并通入氩气保护反应物不被空气氧化。保温结束后，以7.2 ℃/ min 的升温速率升温至260 ℃，保温60 min后停止加热，移去热源冷却至60 ℃。将冷却后的产物移入烧杯，并加入60 mL 的甲苯进行超声分散，用磁铁在烧杯底部进行吸附，当黑色磁性物质基本被吸附至烧杯底部后，弃去上清液，重复该清洗过程2遍。之后黑色沉淀物再用丙酮清洗2遍，分散于去离子水中，即制得PEI/PEG-SPIONs样品。将所得到的PEG/PEI-SPIONs分散到40 mL去离子水中，并加入0.2 g PASP，超声分散直至均匀，然后在50 ℃条件下搅拌60 min，使PASP能够与PEG/PEI-SPIONs充分反应，然后冷却至室温，将反应后得到的样品置入透析袋(MW=10000)中，在去离子水中透析5 d，每12 h更换一次去离子水，直到烧杯内的去离子水颜色变为无色，将样品取出，得到PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液，合成工艺流程由图1所示。

图1 PEG/PEI/PASP-SPIONs制备的工艺流程Fig.1 The preparation process of PEG/PEI/PASP-SPIONs

3 结果与讨论

3.1 TEM分析

图2 PEG/PEI/PASP-SPIONs的TEM图片及粒径分布图Fig.2 TEM images with the size distributions of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

图2为PEG/PEI/PASP-SPIONs的TEM图片及粒径分布图。从图中可以看出，所制备的纳米粒子大小均一，具有较好的分散性[23-25]。量取图中300个粒子的粒径，经过统计学分析计算后得到其平均粒径为(10.8±2.0)nm(平均值±标准差)，所合成的纳米粒子尺度分布较窄。

3.2 水合动力学粒径与zeta电位

表1为PEG/PEI/PASP-SPIONs的粒径、水合动力学粒径及zeta电位。所制备的PEG/PEI/PASP-SPIONs的水合动力学粒径平均值为23.4 nm，其值大于TEM的分析结果10.8±2.0 nm，这是因为水合动力学粒径代表的不只是SPIONs无机晶核的大小。由于PEG/PEI/PASP-SPIONs表面包覆有水溶性的修饰物，加上亲水性的官能团如羟基、羧基，在去离子水中形成吸水的胶团，因此水合动力学粒径会大于TEM表征结果。根据SPIONs的水合动力学粒径大小对PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液进行稳定性研究，将样品的水分散液放置30 d后测得的水合动力学粒径平均值为24.2 nm，两种氧化铁纳米粒子的水合动力学粒径没有发生明显的变化，结果表明样品能够长时间稳定分散在水溶液中。

zeta电位是一个评价胶体分散体系稳定性的重要指标。SPIONs可以在水中稳定分散的主要原因是由于空间位阻效应及静电斥力的作用[26]，利用高温热分解法所制备的PEG/PEI-SPIONs的zeta电位为35 mV，经过接枝了阴离子型的PASP后的PEG/PEI/PASP-SPIONs在去离子水中的分散液的zeta电位为-20.4 mV。PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液具有良好的水分散性及稳定性，主要是由于PASP具有良好的水溶性和生物相容性，表面修饰层接枝PASP后同样可以在去离子水中稳定分散。

表1 PEG/PEI/PASP-SPIONs的粒径、水合动力学粒径及zeta电位Table 1 The sizes, hydrodynamic sizes and zeta potentials of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

3.3 FT-IR表征

图3 PEG/PEI-SPIONs(a)、PEG/PEI/PASP-SPIONs(b) 和PASP(c)的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of the PEG/PEI-SPIONs (a), PEG/PEI/PASP-SPIONs (b) and PASP (c)

图3为 PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs的红外光谱图。在1655 cm-1、1621 cm-1处的-COO-基团[27]的出现是在高温条件下PEG的部分羟基被氧化得到的[28-30]，并结合于氧化铁纳米粒子表面。520 cm-1的吸收峰是氧化铁的Fe-O的特征吸收峰[31-32]，3423 cm-1处出现的吸收峰是PASP的-NH-与PEG、PEI与PASP之间形成的氢键的特征吸收峰[33-34]。3138 cm-1、3014 cm-1处的吸收峰是PEG、PEI和PASP的C-H的特征吸收峰[28,33,35]，1400 cm-1处的吸收峰是PEG、PASP面外弯曲的-OH的特征吸收峰[36]，650 cm-1处的吸收峰是PASP的面内弯曲-OH的特征吸收峰[30,37]。根据上述分析，氧化铁纳米粒子的表面修饰上了PEG、PEI和PASP。

3.4 SPIONs的修饰机理

图4为通过对实验结果进行分析提出的PEG、PEI及PASP共同修饰的SPIONs的表面修饰机理图。在利用高温热分解法制备PEG/PEI-SPIONs过程中，由于氧化还原反应，部分Fe(Ⅲ)被还原成Fe(Ⅱ)，而部分PEG的-OH则是被氧化为-COO-[24]基团与SPIONs表面相结合[38]，而PEI是通过-NH2基团结合于SPIONs表面，另外PEG与PEI之间可能由于氢键的作用相互结合在一起，即PEI中的-NH2与PEG另一端的-OH形成氢键，正是由于这些作用力的存在，使得PEG及PEI与SPIONs表面紧紧地相结合[39]。而PASP与PEG/PEI-SPIONs的接枝是由于PASP上的-OH、COO-与PEG一端的-OH或PEI上的-NH2之间形成氢键而相结合。同时，PEG、PEI与PASP均具有良好的水分散性，从而给SPIONs提供了一个良好的水分散稳定性前提，这也是制备的PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs能够在水中长时间地稳定分散的主要原因。

图4 SPIONs的表面修饰Fig.4 The synthesis and probable coating of the SPIONs

3.5 SPIONs的磁性能及热重分析

图5(a)为所制备得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滞回线曲线图。从图5(a)可以看出，在300 K下，PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滞回线均经过了原点，即样品的剩磁和矫顽力均为0，结果表明所制备的PEG/PEI/PASP-SPIONs具有超顺磁性。同时，从图5(a)中也可以得出，PEG/PEI/PASP-SPIONs的饱和磁化强度分别为30.3 emu/g。图5(b)表示的是PEG/PEI/PASP-SPIONs的25～800 ℃热重曲线，由图5(b)中可以得出，PEG/PEI/PASP-SPIONs总的失重率为33.7%。图5(a)中的PEG/PEI/PASP-SPIONs的饱和磁化强度与PEG/PEI-SPIONs[39]的相差较大，这是由于PEG/PEI-SPIONs与PEG/PEI/PASP-SPIONs表面的有机物修饰层的百分含量不同所导致测定的结果产生的差别，由上述结果可以计算出纯的SPIONs的饱和磁化强度为89.9 emu/g，与计算得到的PEG/PEI-SPIONs的纯的SPIONs的饱和磁化强度(85.0 emu/g)相差不大，SPIONs表面的有机物修饰层种类及数量对纯的SPIONs的饱和磁化强度影响不大。这些结果表明SPIONs在修饰PEG、PEI和PASP后仍然具有较高的饱和磁化强度。

图5 PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滞回线(a)和25～800 ℃热重曲线(b)Fig.5 Hysteresis loop at room temperature (a) of the PEG/PEI/PASP-SPIONs and TGA curve from 25-800 ℃(b)

3.6 SPIONs在小鼠脑部磁共振成像

为了研究PEG/PEI/PASP-SPIONs作为磁共振造影剂的效果，采用Bruker 7 T磁共振成像仪对昆明小鼠进行脑部磁共振成像实验，实验测试参数为：视野=1.8 cm×1.8 cm，矩阵=256×256，层厚=1 mm，回波时间=4 ms、11 ms、18 ms、25 ms、32 ms、39 ms、46 ms、53 ms、60 ms、67 ms、74 ms、81 ms，重复时间=1500 ms，分别对小鼠进行尾静脉注射100 μL PEG/PEI/PASP-SPIONs(浓度均为2.5 mg/kg Fe)。图6(a1)～(a7)为注射PEG/PEI/PASP-SPIONs前后小鼠脑部磁共振成像图，图6(a1)分别为未注射PEG/PEI/PASP-SPIONs前小鼠脑部T2*磁共振扫描图，图6(a2)～(a7)分别是注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 5 min、10 min、30 min、1 h、4 h及24 h后的T2*磁共振扫描图。图6(b)～(f)分别为小鼠尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h后嗅球、前额叶皮层、大脑皮层、丘脑和脑干的T2*值变化柱状图。

由图6(a)可以看出，尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs后小鼠脑部组织的T2*加权磁共振成像呈现整体灰度增加，其灰度都是先增加后降低，进行尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs的小鼠的脑部磁共振成像图像在注射5 min后图6(a2)就达到灰度的最大值，而进行尾静脉注射PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的小鼠的脑部磁共振成像图像在注射30 min后达到灰度的最大值，这可能是由于PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的水分散液的zeta电位值分别为35.0 mV、19.0 mV，而PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液的zeta电位值则是-20.4 mV，可以质子化的PEI能够与表面呈现负电性的细胞膜之间相互作用，部分PEG/PEI-SPIONs可能会短时间滞留细胞膜表面，在修饰了PASP后，聚阴离子型的PASP可以减弱PEI与表面呈现负电性的细胞膜之间相互作用，并加快了PEG/PEI/PASP-SPIONs在血液中循环速率，以致注射了PEG/PEI/PASP-SPIONs的小鼠的脑部磁共振成像的造影达到显著的效果的时间比注射PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的短，并且APSP具有低毒性和良好的生物相容性[1]。与测量分析得到T2*值图6(b)～(f)在小鼠脑部不同区域的变化相一致，表明所合成的PEG/PEI/PASP-SPIONs都能够缩短质子的T2弛豫时间，增强组织成像对比度。根据图6(b)、(c)可以看出，在注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 5 min后在嗅球及大脑皮层的T2*值变化程度比PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的高，而在小鼠的脑干部位尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs(图6(f))与PEG/PEI-SPIONs、PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的T2*值变化程度则是相反的，这可能是由于脑部不同的区域对PEG/PEI-SPIONs、PEG/PEI/Tween 80-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs的滞留的作用效果不一致造成的。实验结果说明PEG/PEI/PASP-SPIONs的造影效果在尾静脉注射5 min后达到最佳的效果。而由图6(b)～(f)可以看出在尾静脉注射24 h后T2*值在脑部不同区域均有不同程度的降低，但与PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]相比较，PEG/PEI/PASP-SPIONs的T2*值降低程度大，这是由于修饰了聚阴离子型PASP的SPIONs可以在血液快速运送，最终大部分被小鼠的肝脏所吸收。其结果表明PEG/PEI/PASP-SPIONs可以长时间在小鼠脑部具有MRI成像效果，但PEG/PEI/PASP-SPIONs在小鼠脑部的成像时间比PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的成像时间更短。在实验过程中，所述小鼠都可以进行正常的生理活动，表明PEG/PEI/PASP-SPIONs的良好的生物兼容性。

图6 小鼠尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs(a1-a7) 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h 后小鼠脑部磁共振成像图，小鼠尾静脉注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h 后嗅球(b)、前额叶皮层(c)、大脑皮层(d)、丘脑(e)和脑干(f)的T2*值变化柱状图Fig.6 T2*-weighted MR images of the KM mouse brains pre-injection and 5 min, 10 min, 30 min, 1 h, 4 h, 24 h after intravenous injection of the PEG/PEI/PASP-SPIONs (a1-a7), relative T2* value of bulbus olfactorius (b), frontal cortex (c), temporal (d), thalamus (e) and brain stem (f) extracted from T2*-weighted MR images of KM mouse brains pre-injection, 5 min, 10 min, 30 min, 1 h, 4 h and 24 h after the intravenous injection of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

4 结 论

以PEG为反应溶剂，PEI为添加剂，利用高温热分解法合成得到PEG与PEI共同修饰的PEG/PEI-SPIONs，再与PASP进行接枝，得到PEG、PEI及PASP共同修饰的PEG/PEI/PASP-SPIONs，结论如下：

(1)成功制备得到了PEG/PEI/PASP-SPIONs，其具有粒子尺寸均一和良好的稳定性及分散性的特点；

(2)通过对KM小鼠进行尾静脉注射所制备得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs，并观察小鼠脑部的磁共振成像的情况，结果表明，所制备得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs具有良好的造影效果，因此PEG/PEI/PASP-SPIONs可以用作磁共振成像造影剂。