高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达

陈文静，刘 平

0 引言

白内障是一种表现为晶状体混浊化的眼病，除老龄化因素外，最常见的危险因素为糖尿病[1]。近30a全国流行病学调查发现，我国糖尿病患者数量增长了17倍，是新的流行病之一[2]。糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)会降低患者生活质量并影响社会经济发展，已成为重大的公共卫生问题[3]。研究表明，白内障发生的基本病理改变是人晶状体上皮(human lens epithelial，HLE)细胞的凋亡，高糖可能诱导HLE细胞凋亡，而氧化应激损伤是主要原因[4]。无氧酵解的代谢通路可代谢晶状体内的大部分葡萄糖，三羧酸循环代谢因需氧而较少发生。DC的形成与葡萄糖关键代谢酶的改变关系密切，其表达情况和作用机制并未被完全阐明，具有较高的研究价值。

图1各组细胞凋亡情况(×400)A：正常对照组；B：氧化应激组；C：高糖诱导组。

表1 引物序列

基因名称上游引物下游引物β-actinGTCCACCGCAAATGCTTCTATGCTGTCACCTTCACCGTTCPFK-1CTACAGTCTCCAACAATGTCCCCACCCATAGTCTCAATGATAPKM1CATTCATCCGCAAGGCATCTGCACCGTCCAATCATCATCTTCHKTGTGAGGTCCACTCCAGATGGCCCATTGTCCCTTACTTTCCSAGGTCTGGGAGTGTTCTGTTTAGGTAGTGGCTTGTATTCTGTOGDCCTTGAGCCTGAGCCTTAGAATCAGGAACAGCAGATAATGGACACG6PDGGAGAATGAGAGGTGGGATGACTGCTGGTGGAAGATGTCG

1材料和方法

1.1材料人晶状体上皮细胞系(HLEB3细胞，中国广州吉妮欧生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS，以色列BI)，青霉素/链霉素(美国Gibco公司)，DMEM培养液(美国Gibco公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(中国安必信)，噻唑兰(MTT，北京赛因坦科技有限公司)，二甲基亚砜(美国Sigma)，总RNA提取试剂盒(中国爱思进)，cDNA试剂盒(日本TOYOBO)，荧光定量PCR试剂盒(日本TOYOBO)；CO2细胞培养箱(美国Thermo)，酶标仪(美国BioTek)，倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS)，Nanodrop 2000c分光光度仪(美国Thermo)，7500 Fast实时定量PCR仪(美国ABI)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组处理使用含体积分数10% FBS的DMEM培养液(葡萄糖5mmol/L)于37℃、体积分数 5% CO2培养箱中培养HLEB3细胞，2～3d换液，传代培养，当细胞呈现对数生长时分为3组：正常对照组(采用DMEM培养液培养，含葡萄糖5mmol/L)、氧化应激组(采用含H2O2200μmol/L的培养液培养)、高糖诱导组(采用含葡萄糖30mmol/L的培养液培养)，均培养24h后进行相应的实验。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测在6孔培养板底部铺盖玻片，将对数生长期的HLEB3细胞接种于其上，每孔2mL，约1×105个细胞，分组培养24h后用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，在500μL 1×Binding Buffer 中加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻轻混匀，将混合液加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖，避光室温反应15min，将盖玻片倒置于载玻片上，使用荧光显微进行双色滤光片观察。

1.2.3 MTT实验检测细胞活力将对数生长期的HLEB3细胞接种在96孔培养板中，每孔100μL，约1×104个细胞，周围孔各用100μL PBS缓冲液填充，并设立凋零孔。分组培养24h后，实验孔每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，将上清液去掉，每孔加入150μL二甲基亚砜，使用振荡器低速振荡10min，充分溶解结晶物。使用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔的OD值。细胞活性=(实验组OD值-调零孔OD值)/(正常对照组OD值-调零孔OD值)×100%。

1.2.4 qRT-PCR 检测mRNA的表达将对数生长期的HLEB3细胞接种在6孔培养板中，每孔2mL，约1×105个细胞，分组培养24h后提取总RNA，紫外分光光度计测RNA浓度(A260/A280)。使用cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用实时定量PCR仪检测6种葡萄糖关键代谢酶[6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)、丙酮酸激酶(PKM1)、己糖激酶(HK)、柠檬酸合成酶(CS)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDC)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)]mRNA的表达，引物序列见表1。反应条件：预变性(95℃ 20s)，PCR反应(95℃ 3s，60℃ 60s，40循环),溶解曲线(95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s)。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

2结果

2.1 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测荧光显微镜下观察，正常对照组细胞凋亡发生较少，氧化应激组和高糖诱导组细胞均发生凋亡，且高糖诱导组细胞凋亡现象最显著，可见凋亡的HLEB3细胞肿胀，胞质疏松，有空泡形成，细胞核大小不一，状态不佳，细胞形态不规则，细胞有重叠现象，见图1。

2.2 MTT实验检测细胞活力MTT实验检测结果显示，正常对照组、氧化应激组、高糖诱导组HLEB3细胞活力分别为100.00%±0.00%、91.90%±5.11%、63.43%±3.40%，差异有统计学意义(F=12.968，P=0.001)。与正常对照组相比，氧化应激组和高糖诱导组细胞活力均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，且高糖诱导组细胞活力低于氧化应激组。

葡萄糖关键代谢酶正常对照组氧化应激组高糖代谢组FPPFK-11.00±0.001.0810±0.02010.8665±0.038119.2340.002PKM11.00±0.000.6941±0.02820.6285±0.0331112.809<0.001HK1.00±0.001.1276±0.05500.8029±0.054457.002<0.001CS1.00±0.001.2058±0.05560.7791±0.0127101.054<0.001OGDC1.00±0.001.2030±0.11220.7702±0.052332.4880.001G6PD1.00±0.001.0817±0.04030.8970±0.016733.3830.001

图2三组细胞6种葡萄糖关键代谢酶mRNA表达情况。

2.3 qRT-PCR法检测6种葡萄糖关键代谢酶的mRNA表达qRT-PCR检测结果显示，正常对照组、氧化应激组、高糖诱导组6种葡萄糖关键代谢酶的mRNA表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)。氧化应激组细胞除丙酮酸激酶外的5种葡萄糖关键代谢酶的表达均高于正常对照组，而丙酮酸激酶的表达低于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。高糖诱导组细胞6种葡萄糖关键代谢酶的表达均低于正常对照组和氧化应激组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2。

3讨论

白内障是由多种致病机制共同作用的结果，已知糖尿病性白内障形成的机制有渗透压改变、蛋白质糖基化和氧化应激等[5]。氧化应激是细胞内氧化-抗氧化的失衡状态，参与了细胞内的多种病理过程，白内障发生过程中最基本的一个环节是晶状体上皮细胞凋亡，也是病理学基础[4]。金子夜等[6]研究发现糖尿病性白内障患者晶状体前囊膜细胞凋亡程度较年龄相关性白内障患者严重，且检测到凋亡相关基因的表达在糖尿病性白内障患者高于年龄相关性白内障。H2O2诱导氧化应激是眼科常用的模拟年龄相关性白内障导致晶状体上皮细胞凋亡模型的方法，本实验使用高糖作为诱导条件，模拟糖尿病性白内障患者体内高糖状态。结果发现，高糖诱导的HLEB3细胞发生凋亡显著，细胞活力明显下降，且细胞凋亡程度较H2O2诱导氧化应激组更加严重。

汤志铮等[7]在最近的研究中发现糖尿病性白内障与糖代谢异常关系密切。葡萄糖参与的代谢途径主要有无氧酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径等。在糖代谢的某一环节出现问题，都能影响葡萄糖代谢水平，引起代谢障碍，进而影响白内障的形成[8]。己糖激酶是无氧酵解的关键酶，将进入细胞的葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖，为其它途径提供底物6-磷酸葡萄糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，参与糖原合成和磷酸戊糖途径[9]。已有研究证明，在高糖条件下，己糖激酶被葡萄糖饱和，山梨醇途径被激活，山梨醇过多堆积造成细胞功能退化促成糖尿病性白内障[10]。山梨醇途径在眼科研究较多，是公认的糖尿病性白内障形成的机制之一[11]。6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶是糖酵解途径的另外两种关键酶，目前在眼科研究较少。三羧酸循环参与糖、蛋白质和脂肪的代谢过程是产生能量腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的主要方式，柠檬酸合成酶是三羧酸循环最重要的酶，可以催化缩合反应产生大量的柠檬酸[11]。α-酮戊二酸脱氢酶也是其重要关键酶，能够产生活性氧，在缺氧损伤时其表达会抑制，活性受到影响[8]。葡萄糖的磷酸戊糖途径是产生NADPH和核糖-5-磷酸的途径，其关键酶为6-磷酸葡萄糖脱氢酶。

本研究发现，6种葡萄糖关键代谢酶在高糖诱导组细胞的表达均低于正常对照组，可以认为在高糖诱导的情况下，葡萄糖代谢的无氧酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径均因为酶的减少，受到了不同程度的抑制，葡萄糖代谢功能失常，使大量葡萄糖堆积于细胞内，无氧条件下且ATP产生不足，促进了细胞的凋亡，进而可能促进了山梨醇途径，加快了白内障的生成进程。此外，我们发现6种葡萄糖关键代谢酶在高糖诱导组细胞的表达水平均低于氧化应激组，说明这些酶表达的减少现象发生在高糖诱导的细胞中是糖尿病性白内障所具有的。氧化应激组细胞除丙酮酸激酶外的5种关键酶表达均高于正常对照组，表明在氧化应激过程中HLEB3细胞的糖代谢过程大部分被促进，产生大量的能量。高糖诱导组细胞凋亡较氧化应激组严重，6种葡萄糖关键酶表达反而下降，在高糖状态下为了减少细胞内葡萄糖，大量的酶被消耗，使糖代谢被抑制，加快了细胞凋亡，进而加快了白内障的形成速度。表明葡萄糖代谢途径受阻会加速晶状体上皮细胞的凋亡，葡萄糖关键代谢酶可以起到一定程度的保护作用。

本研究结果表明，高糖可以诱导HLEB3细胞葡萄糖关键代谢酶的表达水平降低，诱导细胞凋亡，影响细胞活性。由此可见，糖尿病性白内障的形成与糖代谢异常密不可分，未来有望通过调控糖代谢途径进行预防，达到控制甚至逆转晶状体混浊的目标。