NLRP3/IL-1β通路在增殖性糖尿病视网膜病变中的作用机制

肖云兰，冯 霞

0引言

糖尿病是一种严重危害人类健康的全身性疾病，其危害程度仅次于心血管疾病与恶性肿瘤[1]。糖尿病发病机制为胰岛素分泌绝对或相对不足，导致血糖代谢异常，进而引起全身组织出现慢性损伤与功能障碍[2]。由于糖尿病患者长期处于高血糖状态，刺激微血管，导致视网膜受损。研究发现，中国有超过40%的糖尿病患者出现糖尿病视网膜病变，且糖尿病视网膜病变是成年人最常见的失明原因之一[3-4]。故而探究糖尿病视网膜病变的发病机制，提出有效治疗方法，对糖尿病视网膜病变患者具有重要意义。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3，NLRP3)是炎症小体家族成员，具有胞浆识别作用[5]。NLRP3激活后可诱导炎性因子产生，降低细胞在高糖环境中的生存能力。既往研究对NLRP3在胰岛素抵抗与糖尿病发生的关系进行了深入探讨，但关于其在糖尿病视网膜病变中的作用鲜有研究。本研究旨在探究NLRP3/IL-1β通路在糖尿病视网膜病变中的作用机制，现报告如下。

1对象和方法

1.1对象前瞻性研究。收集2015-09/2018-03我院眼科收治的增殖性糖尿病视网膜病变患者49例49眼作为研究组，其中男27例，女22例，年龄38～67(平均43.57±9.82)岁。纳入标准：(1)经内分泌科确诊为2型糖尿病；(2)眼底血管造影和三面镜等眼科专科检查结果符合2002年版国际眼科学术会议提出的增殖性糖尿病视网膜病变诊断标准[6]；(3)无眼部炎性疾病。排除标准：(1)继发性糖尿病；(2)妊娠期女性；(3)依从性低，不能配合检查；(4)近3mo内有眼部外伤史。收集同期来我院进行手术治疗的特发性黄斑裂孔患者41例41眼作为对照组，其中男24例，女17例，年龄39～65(平均42.91±9.54)岁。纳入标准：(1)经光学相干断层扫描与前置镜散瞳眼底检查明确诊断为特发性黄斑裂孔Ⅱ～Ⅳ期并进行手术治疗者；(2)近1mo内无慢性泪囊炎、感染性角膜炎及角膜溃疡等眼部感染性疾病；(3)能积极配合检查。排除标准：(1)合并糖尿病；(2)黄斑裂孔形成时间超过1a；(3)不能耐受手术。两组患者性别构成比、年龄等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究符合我院医学伦理委员会相关标准，并获得批准。所有受试者及家属对本研究充分知情，并自愿签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本收集所有患者均进行血常规、尿常规、凝血功能、血糖等术前常规检查，确认无手术禁忌后，根据患者情况，采用20g/L利多卡因注射液行球后阻滞麻醉或行全身麻醉，行睫状体平坦部三通道闭合式玻璃体切除术，小心剥除研究组患者视网膜增殖前膜与对照组患者黄斑前膜，术中采用无菌注射器抽取每位患者0.5mL玻璃体原液。

1.2.2观察指标分别采用免疫组织化学法检测视网膜增殖前膜与黄斑前膜中NLRP3蛋白表达水平，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定视网膜增殖前膜与黄斑前膜中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平，分别采用硫代巴比妥酸法与黄嘌呤法检测视网膜增殖前膜与黄斑前膜中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用ELISA法检测玻璃体中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)与白介素-18(interleukin-18，IL-18)水平。本研究所有试剂盒均购于南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2.2.1免疫组织化学法将收集的组织经固定、脱水、透明，并用石蜡包埋成块，使用组织切片机(德国Leica，CM1850)将其加工为厚度约4μm的连续切片，依次进行脱蜡、抗原修复及过氧化氢酶阻断，加山羊血清(北京博胜经纬科技有限公司)进行封闭。滴加兔抗人NLRP3多克隆抗体(武汉博欧特生物科技有限公司，1∶100)，置于4℃冰箱中孵育过夜，漂洗后加羊抗兔IgG(北京博尔西科技有限公司)37℃孵育0.5h，再次漂洗，DAB显色(上海康朗生物科技有限公司)，苏木精(上海研谨生物科技有限公司)复染，经梯度酒精脱水及中性树脂封片。由两位具有执业资格的病理科医生独立采用双盲法对染色结果进行观察，避开出血、坏死及刀口区，随机选取10个包含100个细胞的视野进行观察。

1.2.2.2 ELISA法将术中收集的玻璃体原液经低温高速离心机以3000r/min的转速处理15min后，留取上清液，加入反应板孔中，根据试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪(南京德铁实验设备有限公司，HBS-1096A)测定450nm波长下的吸光度值并绘制标准曲线，根据相应吸光度值于标准曲线上确定ROS、IL-1β、IL-18相应浓度。

1.2.2.3硫代巴比妥酸法将收集的组织充分剪碎匀浆，加入2倍体积的蒸馏水充分摇匀，留过滤后液体备用。按照试剂盒说明书进行相应操作后，取2mL样液于10mL比色管中，采用紫外分光光度仪(上海谱元仪器有限公司，1900Plus)测定在530nm波长下的吸光度值并绘制标准曲线，根据相应吸光度值于标准曲线上确定MDA相应浓度。

1.2.2.4黄嘌呤法将收集的组织充分剪碎匀浆，按照试剂盒说明书，依次加入试剂后充分混匀，37℃恒温水浴0.5h。加入0.2mL显色剂后于室温下静置10min，检测550nm波长下的吸光度值并计算SOD活性。

2结果

2.1 NLRP3蛋白表达情况免疫组织化学检测结果显示，NLRP3蛋白阳性表达呈蓝色(图1)。研究组患者中视网膜增殖前膜NLRP3阳性表达者占90%(44/49)，对照组患者中黄斑前膜NLRP3阳性表达者占5%(2/41)，差异有统计学意义(χ2=64.418，P<0.001)。

2.2 IL-1β和IL-18浓度比较研究组患者玻璃体中IL-1β、IL-18浓度(30.84±7.15、97.61±15.73pg/mL)均明显高于对照组(4.63±0.92、52.07±11.38pg/mL)，差异均有统计学意义(t=23.290、15.454，均P<0.05)。

2.3 ROS和MDA水平及SOD活性比较研究组患者视网膜增殖前膜中ROS与MDA水平均较对照组患者黄斑前膜明显升高，但SOD活性较对照组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

3讨论

糖尿病是一种由于胰岛素分泌减少或生物作用降低引起的代谢紊乱性疾病，其最主要的特征为血糖异常升高[1]。目前糖尿病尚无根治办法，仅能控制血糖水平，延缓疾病发展[7]。流行病学调查显示，继心血管疾病与恶性肿瘤之后糖尿病已成为危害人类健康的第三类慢性非传染性疾病[1]。由于长期处于高血糖水平，糖尿病患者易发生肾、眼、血管与神经病变。糖尿病患者微血管病变最常见的症状为糖尿病视网膜病变导致的视力受损[3]。

目前关于糖尿病视网膜病变机制尚未完全明确，但多数学者就炎症反应是糖尿病视网膜病变的重要过程达成共识[8]。郭译侬等[9]研究发现，炎性因子与视网膜细胞死亡及视网膜功能密切相关。Maimaiti等[10]研究指出，炎性因子浸润会导致糖尿病视网膜病变进一步加剧。NLRP3是一种胞浆模式识别受体分子，作为炎性小体家族一员，NLRP3可与凋亡相关颗粒样蛋白及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1形成炎性复合物[11]。活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1可剪切IL-1β与IL-18前体，形成具有活性的IL-1β与IL-18[12]。IL-1β是一种致炎性因子，其水平异常升高可导致组织水肿与破坏[13]。此外，IL-1β除了对胰岛B细胞具有直接破坏作用，还能通过诱导一氧化氮等有毒物质的产生，间接损伤胰岛细胞[14]。IL-18是具有多种生物学效应的细胞因子，其能促进白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)产生，介导前期炎性反应。同时，IL-18促进Fas系统介导的细胞凋亡[15]。本研究发现，NLRP3蛋白在研究组患者中的阳性表达率为90%，明显高于对照组(5%)，提示NLRP3蛋白在糖尿病视网膜病变患者视网膜增殖前膜中呈高表达。同时，本研究发现研究组患者玻璃体中IL-1β与IL-18浓度明显大于对照组患者，提示糖尿病视网膜病变过程中NLRP3/IL-1β通路活跃，通过提高炎性因子的表达加快视网膜病变进程。

图1免疫组织化学法检测NLRP3蛋白的表达(×400)A：NLRP3蛋白在视网膜增殖前膜中表达呈阳性(蓝色为阳性表达)；B：NLRP3蛋白黄斑前膜呈阴性表达。

组别眼数ROS(U/mL)MDA(nmol/mg)SOD活性(U/mL)研究组4931.52±5.8115.06±1.9269.27±11.41对照组4112.74±4.597.34±1.38116.96±26.22t16.77221.50611.506P<0.001<0.001<0.001

注：研究组：增殖性糖尿病视网膜病变患者；对照组：特发性黄斑裂孔患者。

张子怡等[16]研究发现，NLRP3可增加细胞ROS的释放，加重组织氧化损伤。ROS是引起机体氧化应激的主要因素。生理状态下，适当水平的ROS具有传导细胞信号的作用，而ROS水平异常升高可导致细胞损伤，甚至诱导细胞凋亡[17]。MDA是细胞膜上脂质过氧化的重要产物之一，是脂类过氧化的标志。故而临床常将MDA水平用于评价氧化损伤程度[18]。SOD是清除机体内氧自由基的首要物质，其可对抗氧自由基对细胞的损伤作用，同时对已经遭受氧自由基损伤的细胞具有修复作用。SOD活性越高，提示SOD对氧自由基的清除作用越强[19]。本研究发现，研究组患者视网膜增殖前膜中ROS与MDA水平明显高于对照组黄斑前膜，且SOD活性明显低于对照组，提示NLRP3/IL-1β通路可增加氧化因子表达水平，加剧视网膜氧化损伤，这与张子怡等[16]研究结果一致。

综上所述，NLRP3与IL-1β在增殖性糖尿病视网膜病变组织中呈高表达；NLRP3/IL-1β通路可上调炎性因子与氧化因子表达水平，加快疾病进程。