抗细胞膜DNA抗体联合抗核抗体检测在系统性红斑狼疮诊断中的价值

邢红宇，高荣海，邵运禄，梁宁，周君霞

（1.海南省中医院 检验科，海南 海口 570203；2.海口市第三人民医院，海南 海口 571199；3.海口市人民医院 中心实验室，海南 海口 570208）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种由免疫复合物介导和沉积所致的结缔组织慢性炎症性自身免疫性疾病，较为常见，国内SLE患病率约为70/10 万人，妇女中则高达113/10 万人[1]；韩国报道[2]其患病率约26.5/10 万人，且女性患病率约为男性的6 倍。该疾病尚不能治愈，但早诊断、早治疗能够有效改善患者预后，国内患者10年生存率＞90%[3]。自身抗体检测是SLE 诊断的重要方案，其中抗核抗体（antinuclear antibody,ANA）及ANA 谱检测在临床应用中最为广泛，ANA 谱中抗双链DNA（distrand-DNA,dsDNA）抗体、抗核小体抗体（antinucleosome antibody,AnuA）等对诊断SLE特异性较高，但敏感性较差[4]；ANA 敏感性较高，但特异性较低[5]。近期报道[6]提示抗细胞膜DNA（cell membrane associated DNA,cmDNA）抗体对诊断SLE的敏感性及特异性均相对较高。本研究拟重点探讨抗cmDNA 抗体与ANA 联合检测，对诊断SLE 的价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 观察组 选取2016年1月—2017年12月海南省中医院检验科确诊的182 例SLE 患者为观察组。纳入标准：①年龄≥18 岁；②符合SLE 国际合作组织提出的诊断标准[7]。排除标准：①慢性感染、近2个月严重感染病史、近6 个月有过机会感染；②严重的系统性疾病、胃肠道及肝肾疾病患者；③伴其他风湿性疾病，如类风湿关节炎等；④妊娠及哺乳期妇女。其中男性17 例，女性165 例；年龄21～57 岁，平均（30.25±7.45）岁；病程0.5～12年，平均（3.17± 0.58）年。

1.1.2 疾病对照组 选取2016年1月—2017年12月海南省中医院检验科确诊的85 例其他自身免疫病患者为疾病对照组。纳入标准：①年龄、性别与观察组相匹配；②符合各自疾病的公认诊断标准；③不符合SLE 诊断标准。排除标准：参考观察组排除标准。其中，类风湿关节炎患者29 例，原发干燥综合征患者33 例，脊柱关节病患者12 例，其他结缔组织病患者11 例；男性7 例，女性77 例；年龄20～55 岁，平均（30.76±8.13）岁。

1.1.3 健康对照组 2017年6～12月面向海南省中医院内部，募集健康医护工作者50 例为健康对照组。纳入标准：①年龄、性别与观察组相匹配；②身体健康。排除标准：参考观察组排除标准。其中男性5 例，女性45 例；年龄22～53 岁，平均（30.58± 8.58）岁。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：RPMI 1640（美国Gibco 公司），胎牛血清（杭州四季青公司），PBS 粉剂、ANA 检测试剂盒、ANA 谱检测试剂盒（德国欧蒙公司），异硫氰酸荧光素结合的羊抗人IgG（美国Sigma 公司）。主要仪器：高速离心机、微量移液器（德国Eppendorf 公司），37℃温箱BSP-250（上海博迅公司），二氧化碳CO2培养箱（美国Thermo Fisher 公司），超净工作台（苏州净化公司），冷冻冰柜（日本三洋公司）。

1.3 检测方案

所有患者取空腹静脉血10 ml，3 000 r/min 离心，取血清，冷冻保存待测各指标。

1.3.1 抗cmDNA 抗体检测 参考茹晋丽等[8]研究，采用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IIF）检测cmDNA，底物选择人B 淋巴细胞株Raji。检测步骤：①在37℃、5% CO2条件下，以RPMI 1640+10%胎牛血清培养基培养人Burkitt's 淋巴瘤细胞（Raji）细胞，培养至对数生长期，离心收集。②Raji 细胞以磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤2 次，调整密度至0.5×106个/ml 悬浮，在分割的玻片上点成15μl 的点，室温下干燥，甲醛固定3 min，PBS 洗1 次，烘干。再以稀释胎牛血清孵化5 min，用缓冲液和PBS 各洗1 次。③待测血清与一抗结合。取待测血清，以0.2% PBS-聚山梨醇20 稀释血清至1 ∶40，与Raji 细胞在室温下孵育30 min，再以0.2% PBS-聚山梨醇20 洗涤1 次，以PBS 洗涤2 次。④加入二抗。加入异硫氰酸荧光素结合的羊抗人IgG，室温孵育30 min，再以0.2% PBS-聚山梨醇20 洗涤1 次，以PBS 洗涤2 次。最后以甘油PBS 封片剂封固为玻片标本，置于荧光显微镜下观察。⑤结果判定。荧光显微镜下，细胞膜可能产生3 种不同的图形：无荧光、淡的膜荧光、细胞膜周连续的环状强荧光，其中后两者为阳性，无荧光为阴性。

1.3.2 ANA 检测 采用IIF 法检测ANA，基本方案与抗cmDNA 检测类似。血清1 ∶100 稀释，取25 μl，加入反应板，在室温下与HEP-2 细胞和猴肝基质片反应30 min，冲洗，加20 μl 异硫氰酸荧光素标记的抗人球蛋白，室温下孵育30 min，冲洗，封片，置于荧光显微镜下观察。

1.3.3 常规ANA 谱检测 参考文献[9]，选取对SLE诊断特异性较高的自身抗体，包括抗史密斯（Smith,Sm）抗体、AnuA 进行检测。均采用免疫斑点法检测，检测方案参考试剂说明书，待测血清与膜条上包被抗原反应着色判断为阳性。

1.4 诊断方案

设3 种诊断方案，对比分析以确定抗cmDNA 抗体联合ANA 对诊断SLE 的价值。方案一：ANA 串联常规ANA 谱诊断，此为目前常规诊断方案；方案二：抗cmDNA 串联常规诊断方案；方案三：抗cmDNA抗体并联常规诊断方案。其中常规ANA 谱诊断中，任一自身抗体阳性，为常规ANA 谱阳性。串联：当且仅当两者诊断均阳性，联合方案才阳性，否则联合方案为阴性。并联：两者诊断中至少一个阳性，联合方案为阳性，否则联合方案为阴性。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验或配对χ2检验或Kappa 检验，χ2检验的两两比较用Bonferroni法校正P，不需校正时，P＜0.05 为差异有统计学意义，校正后3组两两比较，P＜0.017 为差异有统计学意义，4组两两比较，P＜0.008 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组不同自身抗体阳性情况

3组抗cmDNA 抗体、ANA、抗Sm 抗体、AnuA阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组抗cmDNA 抗体、ANA、抗Sm 抗体、AnuA 阳性率均高于其他各组（P＜0.017）。见表1。

表1 3组不同自身抗体阳性率比较 例（%）

2.2 不同自身抗体对SLE 检出效能比较

以3组共317 例对象为样本总体进行分析。敏感性：ANA 最高，其次为AnuA、抗cmDNA 抗体，抗Sm 抗体最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。特异性：抗Sm 抗体和AnuA 最高，其次为抗cmDNA 抗体，ANA 最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。阳性预测值：AnuA 最高，其次为抗Sm 抗体和抗cmDNA 抗体，ANA 最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性预测值：ANA 最高，其次为AnuA 和抗cmDNA 抗体，抗Sm 抗体最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同自身抗体对SLE 检出效能比较 %

2.3 观察组ANA 和常规ANA 谱阴性者抗cmDNA检出率

观察组ANA 及ANA 谱阴性者，抗cmDNA 检出率均＞50%。见表3。

2.4 方案2 与方案1 诊断SLE 一致性分析

以3组共317 例对象为样本总体进行分析。经McNemar 检验，两种诊断方案的结论不一致，差异有统计学意义（P=0.000）；经Kappa 一致性检验，两种诊断方案有中等的一致性（κ=0.541，P=0.000）。见表4。

2.5 方案3 与方案1 诊断SLE 一致性分析

经McNemar 检验，两种诊断方案的结论不一致，差异有统计学意义（P=0.000）；经Kappa 一致性检验，两种诊断方案有几乎完全一致性（κ=0.894，P= 0.000）。见表5。

表3 观察组ANA 及ANA 谱阴性者抗cmDNA 检出率

2.6 3 种诊断方案对SLE 的诊断效能

敏感性：方案3 均具备最高的敏感性。特异性：方案2 具备最高的特异性。阳性预测值：方案2 具备最高的阳性预测值。阴性预测值：方案3 均具备最高的阴性预测值。见表6。

表4 方案2 与方案1 诊断SLE 一致性分析 例

表5 方案3 与方案1 诊断SLE 一致性分析 例

表6 3 种诊断方案对SLE 的诊断效能比较 %

3 讨论

SLE 是一种对人体健康危害严重的自身免疫性疾病，目前尚不能完全治愈该疾病，但由于自身抗体检测方案的出现与发展，临床已能够做到早期诊断、早期治疗，患者的生存率因此得到显著提升[10-12]。迄今为止，SLE 患者血清中已发现百余种相关自身抗体，其中ANA、抗Sm 抗体、AnuA 在临床中应用较广泛，是诊断SLE 的相对特异性抗体[13-15]。但上述抗体单独应用均存在一定缺陷，本研究显示ANA 敏感性较高，但特异性较差，抗Sm 抗体及AnuA 特异性提升，但敏感性相对较差，与既往报道[16-17]结论相符，因此临床多建议联合检测各种自身抗体。

本研究显示，抗cmDNA 抗体对诊断SLE 有较可靠的价值：其对SLE 的诊断敏感性虽然低于ANA，但高于抗Sm 抗体，与AnuA 接近，同时其对SLE 的诊断特异性亦可达到93.33%，戚建锋等[18]报道该抗体对诊断SLE 的敏感性为62.8%，特异性为92.9%，提示其兼具良好的诊断敏感性与特异性。cmDNA 分子主要表达于人B 淋巴细胞、单核细胞和外周血白细胞膜，细胞膜的cmDNA 结合蛋白可能为其受体，由于SLE 患者存在cmDNA 受体功能障碍，因此cmDNA 不能正常清除，故其能够作为独特的靶抗原，诱导患者产生抗cmDNA 抗体[19]。

本研究观察组中ANA、抗Sm 抗体、AnuA 阴性者，均有超过50%患者能够检出抗cmDNA 抗体，提示后者是ANA 及常规ANA 谱的有效补充，能够避免漏诊，与既往报道[20]结论相符。各项诊断方案对比显示，抗cmDNA 抗体串联常规诊断方案，具有最高的敏感性，而抗cmDNA 抗体并联常规诊断方案，具有最高的特异性，说明其联合常规诊断方案，对SLE 有较可靠的诊断作用。但联合方案中仍存在一定的漏诊及误诊，说明联合诊断方案仍不足以完全有效地检出SLE 患者，因此抗cmDNA 抗体可能仍仅能作为传统诊断方案的补充。

综上所述，抗cmDNA 抗体有助于检出ANA、抗Sm 抗体及AnuA 阴性的SLE 患者，抗cmDNA 抗体联合常规方案诊断SLE 具备较可靠的诊断效能。