热休克蛋白65对小鼠溃疡性结肠炎的作用机制研究*

李小余，王莎，董颖，马旭东，王伟伟，韩江余，邵圣文

（湖州师范学院医学院 微生物与免疫学研究所，浙江 湖州 313000）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）在临床上包括2 个独立的疾病，即溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn's disease）[1]。目前关于IBD 的病因尚不很清楚，较为普遍的看法是遗传易感性、免疫异常、肠道菌群共同参与IBD 发病。UC 发病在我国逐年呈上升趋势[2-3]。有学者认为，UC属于自身免疫病范畴，患者自身免疫反应异常是UC发病的重要因素[4]。UC 疾病具有易复发、易慢性化的特点，在临床上易演变成慢性迁延性疾病，给临床治疗带来困难。目前还没有完全治愈UC 的药物。关于UC 治疗药物和方法的研究一直为临床所重视。有研究指出，热休克蛋白（heat schock protein,HSP）家族成员之一的HSP65 蛋白具有免疫调节功能[5]。本研究探讨HSP65 蛋白是否通过调节性T 细胞（regulatory T cells,Treg）对UC 小鼠产生免疫调节作用，从而抑制小鼠肠道炎症反应，使得小鼠UC 疾病得以缓解，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

68 只C57BL/6 小鼠，雄性，8 周龄，体重18～20 g，合格证编号201703199，购自常州卡文斯实验动物有限公司[许可证SCXK（苏）2016-0010]。PE 标记的抗小鼠CD4 单抗（cat100407）、APC 标记的抗小鼠FoxP3单抗（cat137221）、PE/Cy7 标记的抗小鼠CD25 单抗（cat101915）、FITC 标记的抗小鼠CD3 单抗（cat100305）为美国Biolegend 公司产品。HSP65 蛋白为本实验室自行制备。细胞流式分析采用美国BD 公司的FACS Canto流式细胞仪，数据分析应用FlowJo 软件。

1.2 UC 小鼠模型复制

随机选取62 只C57BL/6 小鼠，适应性饲养3 d 后开始模型复制，每天给予3.5%葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子质量36～50 kD）的灭菌水自由饮用，连续饮用7 d，第8 天起按无特定病原体（SPF）级要求继续饲养14 d，从存活小鼠中随机取2 只处死，取结肠组织行病理检查，结合小鼠UC 疾病活动指数（disease activity index,DAI）评分，验证UC 小鼠模型复制成功。

1.3 HSP65 治疗UC 小鼠

6 只健康小鼠设为正常对照组（A组）。48 只UC小鼠随机分成4组（各12 只）：UC 模型对照组（B组）、低剂量组（C组）、中剂量组（D组）及高剂量组（E组）。A组和B组灌胃给予磷酸盐缓冲液（PBS），C组、D组、E组小鼠分别灌胃给予HSP65 0.5、2.5 及 5.0 mg/kg。每隔1 天灌胃1 次，共7 次。灌胃期间，按SPF 要求常规饲养，末次灌胃后继续饲养2 d。每天观察记录各组小鼠体重和大便性状、便血情况，参照文献计算DAI[6]。

1.4 小鼠检测样品取材

末次灌胃后饲养2 d，腹腔注射氯胺酮后，心脏取血处死小鼠。心脏穿刺取血后分离血清和血液有核细胞，分离小鼠脾脏和肠系膜淋巴结，分别置于无菌平皿中，研碎后提取有核细胞；距回盲部约2 cm 处，取结肠中段组织2 块，分别采用4%甲醛固定及-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.5 HE 染色检查及病理评分

结肠中段组织超薄切片后行HE 染色，光学显微镜检查病理学变化情况，参照文献[7]进行结肠组织病理评分。

1.6 流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞

小鼠脾细胞、淋巴结细胞分离：组织用无菌毛玻璃片研磨1～2 次，200 目滤网过滤，1 500 r/min 离心5 min，弃上清液；加入1 ml 预冷的红细胞裂解液，冰上 裂解5 min，70 μm 孔径细胞筛再次过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS 洗涤细胞2 次，重悬细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml 待用。全血细胞处理：向抗凝血加入1 ml 预冷的红细胞裂解液，冰上裂解5 min，其余处理步骤同脾细胞处理方法，得到血液中的有核细胞。调节以上细胞浓度为5×105个/ml，在冰上加入PE 标记的CD4 单抗，FITC 标记的CD3单 抗，PE/Cy7 标记的CD25 单抗，4 ℃避光孵育30 min；染色结束后，PBS 洗涤，4%多聚甲醛重悬细胞，4℃孵育20 min；0.1%皂素4℃孵育20 min，细胞破膜；PBS 洗涤2 次，加入APC 标记的Foxp3 单抗，4℃孵育20 min，洗涤2 次，流式细胞仪收集数据进行分析：CD4+T 细胞数，CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞数，计算Treg 细胞数占CD4+T 细胞数的比例。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0 软件。计量资料以均 数±标准差（±s）表示，比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用Dunnett T3 法，独立测量数据两两比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠疾病活动指数

不同剂量HSP65 治疗UC 小鼠的DAI 评分见表1，结果显示：①不同时间点的小鼠DAI 评分有差异（F= 374.465，P=0.000）；②各组小鼠DAI 评分有差异（F=57.057，P=0.000），HSP65 治疗UC 小鼠14 d 后，D组和E组小鼠DAI 评分均低于B组小鼠（P＜0.05），E组小鼠DAI 评分低于D组（P＜0.05）；③HSP65 治疗UC 小鼠14 d 后，各组小鼠DAI 评分变化趋势有差异（F=64.895，P=0.000）。

表1 各组小鼠DAI 评分的比较（n =12，±s）

表1 各组小鼠DAI 评分的比较（n =12，±s）

组别 第1 天 第14 天B组 3.84±0.19 3.66±0.39 C组 3.87±0.18 3.07±0.15 D组 3.78±0.21 1.50±0.43 E组 3.82±0.31 0.83±0.31

2.2 小鼠结肠组织病理改变情况

A组小鼠结肠组织结构正常；B组小鼠结肠组织黏膜结构破坏严重，隐窝结构破坏，黏膜下和肌肉层大量细胞浸润；C组小鼠结肠组织黏膜结构有中度损伤，黏膜下和肌肉层有中等程度细胞浸润；D 和E组，小鼠结肠组织结构基本正常，黏膜下和肌肉层有少量细胞浸润。见图1。

图1 小鼠结肠组织病理检查结果（HE×100）

HSP65 治疗UC 小鼠14 d 后，各组小鼠结肠病理评分有差异（F=68.641，P=0.000）；C、D 及E组小鼠 的结肠组织病理评分分别为（3.20±0.42）、（1.80± 0.79）及（1.10±0.57）分，均低于B组（3.70±0.48）分（P＜0.05）；E组小鼠的结肠组织病理评分低于C、D组（P＜0.05），D组小鼠结肠组织病理评分低于C组（P＜0.05）。

2.3 小鼠血液、脾脏、淋巴结CD4+CD25+Foxp3+表型的Treg 细胞比例

HSP65 治疗14 d 后，各组小鼠的血液、脾脏以及肠系膜淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+表型的Treg 细胞检测结果见表2。①各组小鼠血液Treg 细胞比例有差异（F=4.678，P=0.006），与A组比较，B、C、D、E组小鼠血液Treg 细胞比例均降低（P＜0.05）；②各组小鼠脾脏Treg 细胞比例有差异（F=5.786，P=0.002），与A组比较，B、C、D、E组小鼠脾脏Treg 细胞比例均降低（P＜0.05）；③各组小鼠肠系膜淋巴结Treg 细胞比例有差异（F=8.579，P=0.000），与A组比较，B、C组小鼠肠系膜淋巴结Treg 细胞比例降低（P＜0.05），与B组比较，C、D、E组小鼠肠系膜淋巴结Treg 细胞比例升高（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血液、脾脏、淋巴结中的Treg 细胞 比例比较（%，±s）

表2 各组小鼠血液、脾脏、淋巴结中的Treg 细胞 比例比较（%，±s）

注：①与A组比较，P ＜0.05；②与B组比较，P ＜0.05。

淋巴结Treg 比例A组 6 5.29±1.78 10.46±1.21 10.96±1.19 B组 12 3.06±0.81① 7.52±1.10① 6.29±1.41①C组 12 3.15±0.97① 8.13±1.05① 9.12±0.97①②D组 12 3.32±0.74① 8.65±0.91① 9.79±1.52②E组 12 3.20±0.65① 8.83±1.30① 10.07±2.10②组别 n 血液Treg 比例脾脏Treg 比例

3 讨论

HSP 家族蛋白广泛存在于真核及原核生物细胞中。一般而言，当细胞处于应激状态时，HSP 家族蛋白启动表达，发挥保护细胞之功能。HSP 家族蛋白成员众多，包括HSP60、HSP70、HSP90 等家族蛋白。HSP60 家族蛋白成员包括哺乳动物来源的HSP60 蛋白和结核杆菌HSP65 蛋白，两者高度同源，能够发生交叉免疫反应[8]。国外学者发现，在UC 患者结肠黏膜组织内，包括HSP60、HSP10、HSP70、HSP90 蛋白在内的多种HSP 家族蛋白异常增多，这些异常增多的HSP 家族蛋白通过分子模拟机制激活机体免疫系统，诱导机体产生针对结肠黏膜组织的异常自身免疫应答，造成结肠黏膜组织发生炎症反应，患者则出现相应的UC 临床症状[9-10]。

已有研究表明，口服HSP60 蛋白或HSP65 蛋白，可以缓解自身免疫性疾病[5]。有学者报道，对ApoE基因敲除小鼠，通过高脂饮食饲养复制动脉粥样硬化模型，实验组小鼠在高脂饮食同时口服给与HSP60 蛋白，实验组小鼠大动脉根部的粥样斑块大小比模型组减小，实验组小鼠血浆IL-10 比模型组增加，实验组小鼠血浆Ⅱ型干扰素（IFN-γ）比模型组减少，表明口服HSP60 蛋白可以使小鼠动脉内的粥样斑块减小，同时可以抑制小鼠体内的炎症反应[11]。本研究结果证实，HSP65 蛋白可以改善UC 小鼠的疾病活动指数，使UC 小鼠病变的结肠组织结构基本恢复正常。本研究还观察到，HSP65 蛋白对UC 小鼠的治疗效应跟HSP65 蛋白之间存在剂量依赖性。考虑到治疗成本和依从性，笔者建议治疗方案为：HSP65 蛋白以2.5 mg/kg体重的剂量灌胃UC 小鼠，1 次/d，间隔1 d，连续7 次。

Treg 细胞属于CD4+T 细胞亚群，主要通过抑制效应T 细胞的免疫活性而发挥负向免疫调节作用，在维持免疫耐受、抑制过度炎症反应和免疫病理方面有重要作用[12-13]。Treg 细胞包括2 种表型，即静止Treg 细胞和活化Treg 细胞。核转录因子叉头蛋白（forkhead box p3,Foxp3）是活化Tregs 细胞的特异性标志[13]。当静止Treg 细胞开始表达Foxp3，细胞转变成活化Treg细胞，细胞表型也由静止Treg 细胞（CD4+CD25+表型）转变为活化Treg 细胞（CD4+CD25+Foxp3+表型）。活化Treg 细胞能够分泌抑制性细胞因子白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β），抑制效应性T 细胞的功能，进而阻止或减轻炎症反应[13]。

本研究显示，UC 小鼠给予HSP65 蛋白后，小鼠血液和脾脏组织中的活化Treg 细胞比例未发生改变，但是小鼠肠系膜淋巴结中的活化Treg 细胞比例增加。由此，笔者认为，HSP65 蛋白是通过诱导UC 小鼠肠系膜淋巴结中的活化Treg 细胞比例增加来实现。接下来的问题是：UC 小鼠给予HSP65 后，肠系膜淋巴结中增多的活化Treg 细胞来源是哪里？由于小鼠血液和脾脏组织中的活化Treg 细胞比例未发生明显改变，这就排除肠系膜淋巴结中增多的活化Treg 细胞是从血液和脾脏组织迁移而来的可能。那么，肠系膜淋巴结中增多的活化Treg 细胞很可能是由肠系膜淋巴结中的静止Treg 细胞转化而来。

总之，采用灌胃方式给予HSP65 蛋白可以缓解小鼠溃疡性结肠炎，其中可能的机制是：HSP65 蛋白通过激活小鼠肠系膜淋巴结中的静止Treg 细胞，使之转变成活化Treg 细胞，进而增加小鼠肠系膜淋巴结中的活化Treg 细胞比例，随后通过活化Treg 细胞分泌抑制性细胞因子，从而发挥抑制肠道炎症反应作用。