泡菜发酵中不同蒜浓度、pH和盐度组合对大肠杆菌生长影响的模拟研究

闫鸣霄，吴正云，司育雷，全江龙，张文学

(四川大学 轻纺与食品学院 食品工程系，成都 610065)

泡菜是以新鲜蔬菜为原料，添加适量盐，经自然发酵或添加外源发酵剂发酵的蔬菜制品。泡菜制作中，原料和操作环境可能带来包括食源性致病菌在内的各种微生物污染[1,2]。大蒜是泡菜制作中的常用辅料，除增加风味、改善口感等作用外，还能抑制大肠杆菌等常见食源性致病菌的生长[3]。泡菜发酵是一个动态过程，pH等指标随发酵的进行而改变，此外，发酵盐度和温度在不同的操作中也有较大差异，这些因素都可能对控制泡菜中大肠杆菌的生长产生影响。目前对泡菜中大肠杆菌的研究多集中在筛选抑制大肠杆菌的菌株等方面[4,5]，对影响其生长的环境因素探讨不多。本研究参考泡菜发酵过程，通过模拟试验探究大蒜、盐度、pH、温度等因素对大肠杆菌生长的影响规律。

1 材料与方法

1.1 菌株

大肠杆菌Escherichiacoli(CICC 10305)。

参考郭永刚等的方法[6]，采用LB培养基进行菌株活化与菌悬液制备。

1.2 大蒜提取液制备

新鲜大蒜：购于成都市郭家桥综合农贸市场。将10 g大蒜捣碎后于50 mL 80%乙醇溶液中萃取24 h，超声30 min后抽滤，在8000 r/min下离心10 min，取上清液于转速10 r/min、温度50 ℃下旋蒸浓缩，得到蒜提取液10 mL(浓度1 g/mL)[7]。

1.3 不同大蒜浓度、盐度、pH和温度组合条件下的大肠杆菌抑制试验

选用蒜浓度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)、pH(4，4.5，5，5.5，6，6.5)、盐度(1%、2%、3%、4%、5%、6%)和温度(20，28，37 ℃)4个因素进行均匀试验设计(见表1)，以LB培养基为基础培养基，按照均匀设计表调整各组培养基以探究大蒜浓度、盐度、pH、温度对大肠杆菌生长的影响。盐度通过外加氯化钠、pH用乳酸和氢氧化钠溶液调节。培养基经121 ℃、20 min灭菌，冷却后加入蒜提取液。各试验组于对应温度培养72 h，每隔6 h测定OD600值[8]，以LB培养基为对照，每个试验组做3次平行，取平均值作为测定结果。

表1 均匀试验设计U12(12×62×3)Table 1 Uniform experimental design U12(12×62×3)

1.4 低盐条件下不同pH和大蒜浓度组合的大肠杆菌抑制试验

确定各试验组均为盐度2%、温度28 ℃，对pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜浓度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)进行组合(共50种组合)。以模拟常见发酵温度下低盐泡菜的发酵环境，探究低盐下大蒜浓度和pH对大肠杆菌生长的影响规律，具体操作同1.3。

1.5 数据处理

采用Logistic模型拟合大肠杆菌生长[9]，并考虑生长延迟期：

当t

(1)

式中：X为大肠杆菌的OD600值；X0为t=0时对应的OD600值；Xmax为最大生物量对应的OD600值；t为生长时间，h；td为延迟期，h；μmax为最大比生长速率，h-1。

采用逐步回归分析蒜浓度、盐度、pH、温度对大肠杆菌生长的影响规律。

采用Matlab V7.1软件进行试验数据拟合；采用SAS V6.12软件进行逐步回归分析。

2 结果与讨论

2.1 不同大蒜浓度、盐度、pH和温度组合对大肠杆菌的影响

在不同蒜浓度、盐度、pH和温度组合条件下，大肠杆菌的生长趋势明显不同，见图1。

图1 不同蒜浓度、盐度、pH和温度组合对大肠杆菌生长的影响Fig.1 The effect of different combinations of garlic concentration, salinity, pH and temperature on the growth of E. coli

由图1可知，在72 h后，7号延迟期长于对照组，但在第2天时表现出明显的对数增长趋势。此外，9号在54 h出现增长趋势，提示大肠杆菌生长未被完全抑制。其余各组对大肠杆菌生长有明显的抑制作用，生长量比对照组减少了94%以上。为探讨大蒜浓度、pH、盐度和温度等因素对大肠杆菌的影响规律，以4个因素为自变量，大肠杆菌生长量、生长延迟期和最大比生长速率分别为因变量，进行逐步回归分析，得到如下方程：

Xmax=-0.36-0.13S盐度+0.19pH，R2=0.516。

(2)

td=88.16+0.46G蒜浓度pH-1.47pH2，R2=0.614。

(3)

式中：Xmax为最大生物量对应的OD600值；td为延迟期，h；S盐度为盐度，%；G蒜浓度为大蒜浓度，%。

根据以上方程，大肠杆菌生长量受盐度和pH影响较大。在所研究的范围内，盐度越高，pH越低，则大肠杆菌生长量越低，符合杨振泉等[10]、廖春丽等[11]关于盐度、pH影响大肠杆菌生长结果的报道。大肠杆菌生长延迟期受蒜浓度和pH影响较大。较高的pH下，大蒜浓度对大肠杆菌的抑制作用更明显，提示pH可能是影响大蒜抑制大肠杆菌生长的主要因素，这可能与蒜的有效抑菌成分大蒜素在pH为 6.5时具有最强抑菌活性有关[12]。pH的二次方项表明pH与延迟期存在非线性关系，当pH处于某适中区间时，大肠杆菌延迟期达到极值，而该pH区间范围则与蒜浓度有密切的关系，在考察范围内，pH越低，蒜浓度越高，大肠杆菌延迟期越长。对大肠杆菌最大比生长速率的逐步回归分析未得到有意义方程(详细结果略)。分析R2值较低的原因在于自变量数较多，取值范围较大，逐步分析所得变量之间关系较为复杂。

2.2 低盐条件下不同pH和大蒜浓度组合对大肠杆菌的影响

由回归方程(2)、(3)可知，在所考察范围内，温度对大肠杆菌的生长影响不大；当盐度较低时，大肠杆菌将出现更大幅度的生长。鉴于泡菜低盐度发酵的发展趋势[13]，对2%盐浓度下不同pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜浓度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)组合对大肠杆菌生长的影响进行了测试，并采用方程(1)对大肠杆菌的生长曲线进行拟合获得参数(详细结果略)。以pH、蒜浓度为自变量，大肠杆菌生长量、生长延迟期和最大比生长速率分别为因变量，进行逐步回归分析，得到如下方程：

Xmax=2.68+0.64pH-0.01G蒜浓度pH，R2=0.679。

(4)

td=193.54-30.45pH+1.19G蒜浓度pH-0.40G蒜浓度2，

R2=0.715。

(5)

μmax=0.30+0.07pH，R2=0.689。

(6)

式中：μmax为最大比生长速率，h-1。

根据以上方程，2%盐度下，pH越低，大肠杆菌生长量越低；生长量还受蒜浓度和pH的交互作用影响，较高的pH下，大蒜浓度对大肠杆菌的抑制作用更明显。由图2可知，大肠杆菌生长延迟期受pH和蒜浓度的影响较大，pH降低能延长大肠杆菌延迟期；蒜浓度的二次方项表示蒜浓度与延迟期存在非线性关系，在考察范围内，蒜浓度越高，pH越低，大肠杆菌延迟期越长；蒜浓度与pH的交互作用说明：相较低pH，高pH下蒜浓度对大肠杆菌生长量影响更大；相较高浓度蒜，低蒜浓度下pH对大肠杆菌生长量影响更大。此外，pH越低，大肠杆菌最大比生长速率越低。

图2 低盐下蒜浓度和pH对大肠杆菌的生长延迟期的影响Fig.2 The effect of garlic concentration and pH on the delay period of E. coli under low-salt condition

结合拟合结果可知，在pH为5～6.5和低浓度蒜组合条件下，大肠杆菌的延迟期明显短于对照组，提示低浓度的蒜可能对大肠杆菌生长有一定的促进作用，并且该作用与pH范围有关。以大蒜浓度(0%～3%)和pH为自变量，大肠杆菌生长延迟期为因变量，进行逐步回归分析，得到如下方程：

td=745.56-237.64pH-15.84G蒜浓度+19.29pH2+7.20G蒜浓度2，R2=0.8067。

(7)

图3 低盐下低蒜浓度对大肠杆菌生长延迟期的影响(pH 6)Fig.3 The effect of low-garlic concentration on the delay period of E. coli under low-salt condition (pH 6)

结果显示：在考察范围内，大肠杆菌生长延迟期与pH和蒜浓度有关，且二者与大肠杆菌生长延迟期均为非线性关系且不存在交互作用。根据方程计算，当pH为6～6.5、蒜浓度为1%左右时，大肠杆菌生长延迟期最短，提示低浓度的蒜对大肠杆菌生长具有一定的促进作用。当pH 为6、蒜浓度为0%～2.1%时，大肠杆菌生长延迟期明显短于对照组(见图3)。类似的情况在甘草、黄芪等[14,15]天然药材中也有报道。

结合泡菜发酵的环境因素考虑，在泡菜发酵，尤其是低盐泡菜发酵中，蒜浓度至少应大于2%才能发挥抑菌作用。由于泡菜发酵微生物种类和环境因素复杂，大肠杆菌的生长情况受到了多方面因素的综合影响。本研究所选因素有限，分析结果的精确性受到一定限制，但仍可为进一步研究提供参考。

3 结论

通过模拟试验考察了泡菜发酵中大蒜浓度、盐度、pH和温度等因素对大肠杆菌生长的综合影响。结果显示：pH和蒜浓度是影响大肠杆菌生长最主要的因素，其次是盐度；高盐低pH下大肠杆菌生长幅度较小；较低pH和较高蒜浓度下大肠杆菌生长延迟期较长。低盐浓度(2%)条件下，pH和蒜浓度仍是决定大肠杆菌生长延迟期的主要因素，相较低pH，高pH下蒜浓度对大肠杆菌生长量影响更大；相较高浓度蒜，低蒜浓度下pH对大肠杆菌生长量影响更大；最大比生长速率则主要受pH影响。低盐(2%)低蒜浓度(0%～4%)下，pH和蒜浓度对大肠杆菌的延迟期呈现更为复杂的影响，pH 6～6.5和蒜浓度1%时大肠杆菌生长延迟期最短。