芹菜素对肺癌PC9GR细胞侵袭和迁移的抑制作用及机制

李 彬 蔡 悦 陈 汇*

（1 华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030；2 华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，湖北 武汉 430030）

芹菜素 （4'，5，7-trihydroxyflavone，Apigenin，APG），又名芹黄素，是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于多种植物如旱芹、洋甘菊、紫苏、马鞭草中［1］。国内外大量研究发现，芹菜素是天然抗氧化剂，具有降血压和舒张血管、预防动脉粥样硬化等抗心血管病作用［2］。近年来，芹菜素在抗肿瘤方面的作用逐渐被发现和认可。研究表明，芹菜素对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等实体肿瘤均具有抑制作用［3-8］。在乳腺癌和肺癌中，芹菜素对一些化疗药物也显示出增敏或逆转耐药作用［4，9-10］。与其他黄酮类化合物（槲皮素、山奈黄酮）相比，芹菜素具有低毒、无诱变性等特点［11］。因此，芹菜素作为天然高效且低毒的抗肿瘤药物，已成为目前肿瘤辅助治疗领域的研究热点之一。本研究在PC9GR细胞中探究芹菜素对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，并初步研究相关分子机制，以期为晚期肺癌治疗提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 芹菜素（HPLC≥98%，标准品） 购自大连美仑生物技术有限公司，DMEM高糖培养基、PBS缓冲液购买于Hyclone公司，胎牛血清来自浙江天杭生物科技股份有限公司，CCK-8试剂盒购买于武汉庄盟生物科技有限公司，Transwell板、Matrigel基质胶购于美国Corning公司，蛋白提取相关试剂均来自上海碧云天生物技术有限公司。实验用兔抗人E-cadherin抗体、兔抗人N-cadherin抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人MMP-2抗体购买于CST公司，兔抗人Snail抗体、鼠抗人Slug抗体、兔抗人VEGF抗体为美国Santa Cruz公司，鼠抗人 β-actin抗体来自Abbkine，羊抗兔、鼠抗兔IgG购于武汉大风生物科技有限公司。本研究所用PC9GR细胞为逐步诱导所得，由我院胸外科实验室馈赠。实验用水为超纯水，所用其他化学试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及形态观察 PC9GR细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。将对数生长期细胞随机分组，以2×105个/孔接种于六孔板。细胞贴壁24 h后，将孔内培养基替换为含药培养基。实验组分别加入含有10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培养基，阴性对照组加入含0.1%DMSO的完全培养基。培养48 h后，将六孔板置于Olympus IX71倒置显微镜白光下观察细胞形态，使用Image-Pro Plus IPP 7.0图象分析软件对细胞形态进行图像采集。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 取生长状态良好细胞，消化计数后以3×103个/孔将细胞均匀接种至96孔板中，置于37℃培养箱中培养。细胞贴壁24 h后，将各孔培养基替换为含药培养基。其中10 μmol/L组、20 μmol/L 组分别加入含有 10 μmol/L、20 μmol/L 芹菜素的培养基，阴性对照组加入含0.1%DMSO的完全培养基，每组设5个复孔。培养48 h后，吸除孔内培养基，用不含血清的培养基漂洗2遍 。每孔加入 100 μL含10%CCK-8的培养基，37℃继续培养2 h。采用全自动酶标仪在450 nm波长处测量各孔吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.3 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力 取生长状态良好细胞，消化计数后用无血清的培养基重悬细胞，调整悬液浓度，以每孔5×104个的密度将细胞接种至预铺好Matrigel的Transwell小室的上室，下室中加入含药培养基。10 μmol/L 组、20 μmol/L 组分别加入含 10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培养基，阴性对照组为含0.1%DMSO的完全培养基。每组设3个复孔，迁移实验无需铺胶。将Transwell板置于37℃培养48 h（侵袭实验） 或24 h（迁移实验）。细胞侵袭和迁移完成后，用培养基润湿的棉签轻轻拭去上室表面的细胞，移出小室。用4%多聚甲醛固定后将小室置于0.1%结晶紫溶液中，浸润染色30 min。光学倒置显微镜下随机选取5个视野，拍照并统计穿膜细胞数目，取平均值。

1.2.4 Western blot检测相关蛋白的表达 采用Western blotting 检测 E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、MMP-9、MMP-2及VEGF等相关蛋白的表达。取对数生长期细胞，以适当密度接种于培养皿。细胞分组及给药同1.2.1。常规培养48 h后，收集细胞。将培养皿置于冰上，加入适量含PMSF的RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解5 min，提取细胞总蛋白液。按 BCA法测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液，100℃水浴变性。将蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳后，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入适量一抗稀释液，4℃孵育过夜。漂洗后加入适量HRP标记的二抗，室温孵育 2 h后，ECL化学发光法显影。结果采用Gel-Pro图像分析软件读取目的条带灰度值，以β-actin为内参 ，计算目的蛋白与对应内参灰度值的比值，将其作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件处理，本研究实验均重复3次，所有数据以平均值±标准差表示，组内数据采用t检验分析，组间比较采用ANOVA方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素对PC9GR细胞存活率的影响 在PC9GR细胞中加入不同浓度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素处理48 h后，观察细胞形态，采用CCK-8法检测细胞存活率。结果显示，和阴性对照组相比，2个浓度组芹菜素作用后PC9GR细胞存活率均有一定程度的降低，其中20 μmol/L组差异具有统计学意义（P＜0.05）。芹菜素组PC9GR细胞形态趋向延展，体积增大，上皮样特征增强（见图 1）。

图1 不同浓度芹菜素对PC9GR细胞形态和细胞存活率的影响（100×）

2.2 芹菜素对PC9GR细胞侵袭和迁移能力的影响 经不同浓度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素处理后，观察并统计细胞穿膜数目，以检测细胞侵袭和迁移能力的变化。如图所示，和阴性对照组相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素组中细胞穿膜数目显著减少（均P＜0.05），细胞侵袭能力降低，并且20 μmol/L组明显低于10 μmol/L组（图2.A）。细胞迁移实验显示，和阴性对照组相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素组中细胞穿膜数目也明显减少（均 P＜0.05），细胞迁移能力降低（图2.B）。上述结果提示芹菜素明显降低PC9GR细胞的侵袭和迁移能力。

图2 不同浓度芹菜素对PC9GR细胞侵袭（A）和迁移（B）的影响（100×）

2.3 芹菜素对EMT相关蛋白表达的影响 不同浓度（10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素干预 48 h 后，将提取的细胞总蛋白进行Western blot检测。和阴性对照组相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素组中，PC9GR细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白表达显著上调（P＜0.05），并且具有浓度依赖性。与EMT相关的转录因子中，Snail表达显著减少（P＜0.05）。另外，和肿瘤转移有关的金属基质蛋白酶MMP-9和血管内皮生长因子VEGF蛋白表达也明显减少（P＜0.05）。在上述浓度芹菜素作用下，PC9GR细胞中间充质标志物N-cadherin，转录因子Slug及金属基质蛋白酶MMP-2的蛋白表达变化均不明显（P＞0.05）。

图3 不同浓度芹菜素对EMT相关蛋白表达的影响

3 讨论

肺癌是我国近年来发病率和病死率均较高的恶性肿瘤［12］，其死亡率较高的主要原因有容易复发转移和产生化疗抵抗［13-14］。众所周知，肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强是肿瘤复发转移的必要条件，往往伴随着细胞形态学特征的变化［15］。对晚期肺癌患者来说，抑制肿瘤复发和转移的速度能显著延长患者的生存期和提升生活质量［14，16］。诸多研究表明，芹菜素对卵巢癌、前列腺癌和肝癌等肿瘤都具有抑制侵袭和转移的作用［3，17-19］。芹菜素可抑制肺癌细胞增殖和诱导凋亡，但其对肺癌侵袭和转移的影响目前尚无报道。本研究发现，浓度为10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可显著抑制肺癌PC9GR细胞的侵袭能力和转移能力。在该作用浓度下，芹菜素对PC9GR细胞的生长仅产生较弱的抑制作用，因而可减少增殖抑制作用对侵袭和转移的影响。同时，研究发现芹菜素处理可增强PC9GR细胞的上皮形态特征，这与上述结果一致。本研究结果提示，芹菜素具有抑制肺癌转移的潜力，为晚期肺癌的治疗可提供参考。

研究表明，芹菜素可通过上调PTEN蛋白表达［20］、调控 Wnt信号通路［21］、影响 Akt信号［7，22］等途径发挥抗肿瘤作用。本研究中芹菜素可明显抑制PC9GR细胞的侵袭和转移能力，增强其上皮形态特征，但这些作用是如何产生的尚不清楚。通过检测PC9GR细胞中EMT标志物及相关转录因子，我们发现芹菜素可显著促进上皮标志物E-cadherin的表达，并且呈浓度依赖性，同时下调下游转录因子Snail的蛋白表达。E-cadherin表达增加与细胞上皮样形态特征增强是一致的，这进一步证实了芹菜素对侵袭和转移的抑制作用。芹菜素干预对间充质标志物N-cadherin及其他下游转录因子Slug影响不明显，可能是因为它们不是芹菜素的主要作用靶点。另外，和肿瘤转移有关的金属基质蛋白酶MMP-9和血管内皮生长因子VEGF蛋白表达也明显减少。上述结果表明芹菜素可能通过影响多种信号途径降低肺癌细胞的侵袭和转移能力。至于芹菜素究竟是如何影响上述蛋白表达的，值得我们进一步研究。有文献报道E-cadherin在肺癌细胞中的表达具有表观遗传调控的可能［23］，这可能成为我们深入研究的方向。

既往报道表明芹菜素对肿瘤细胞具有多种抗肿瘤作用，而诱导细胞凋亡和增殖抑制作用是芹菜素发挥抗癌作用的主要途径。研究表明芹菜素还可抑制结肠癌SW620细胞和肝癌Hepg2细胞的葡萄糖摄取［24-25］，干扰其能量代谢，进而影响细胞增殖和凋亡等过程。另外，芹菜素还可通过诱导细胞产生自噬［26］，对抑癌基因的表观遗传调控［27］以及对化疗药物的增敏作用［10］等途径产生抗肿瘤作用。肿瘤复发和转移是肺癌治疗的难点之一，PC9GR细胞作为吉非替尼耐药细胞株，具有较强转移能力，是研究晚期肺癌治疗的良好载体。本研究表明10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可显著抑制PC9GR细胞的侵袭能力和转移能力，并且在该较低浓度下不会产生明显细胞毒性作用，这为芹菜素在肺癌治疗中的应用又提供了有益参考。结合芹菜素可抑制乳腺癌和肝癌等多种肿瘤侵袭能力的事实，芹菜素的抗肿瘤转移作用值得深入研究。

综上，本研究表明芹菜素可抑制肺癌PC9GR细胞的侵袭和迁移能力，并且这可能与上调E-cadherin的表达，减少Snail、MMP-9以及VEGF的表达有关。至于芹菜素在体内的抗肺癌转移作用如何，以及和其他抗肿瘤药物的联合应用，将是我们接下来将要研究的内容。