西藏那曲市1株牦牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定

罗润波,高家登,钱雯娴,周赛赛,索朗斯珠*

（1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市畜牧兽医技术推广站，西藏 那曲 852000）

产气荚膜梭菌，旧称魏氏梭菌、产气荚膜杆菌，是一种临床条件致病菌，广泛分布于人、环境和牲畜的胃肠道[1-4]，是造成动物坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽的主要病原菌之一。产气荚膜梭菌所产生的毒素种类较多，目前已发现的毒素至少20种[5]，且均为蛋白质。根据该菌产生四种主要致死性毒素（α、β、ε和ι）的种类不同而被分为A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι） 五 种毒素类型[6]。

产气荚膜梭菌引起的牦牛疾病时有报道[7-9]。西藏地区也有发生不明原因的牦牛死亡，死亡牛可见四肢前后伸直、口腔流液体、肛门外翻且充血、腹泻等症状，部分牦牛病程3～5 d、有的1 d死亡。剖检可见实质器官的广泛性出血。小肠针尖样出血，也可见“血肠样”，大肠充气、黏膜出血，胆囊高度肿胀，膀胱积尿，皱胃黏膜充血，瘤胃可见血块。

为确诊该病病原，本试验采集病死牦牛的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、小肠内容物等病料，实验室进行细菌分离，通过分离鉴定，以确定引起该牦牛死亡的主要病原菌。

1 主要材料

1.1 病料

采集一头疑似产气荚膜梭菌感染引起死亡的牦牛的肝脏、肾脏、心脏、脾脏以及小肠内容物。

1.2 主要试剂及仪器

哥伦比亚血琼脂平板（江门市凯林贸易有限公司），厌氧罐、厌氧产气袋（日本三菱化学公司），厌氧肉肝汤培养基、卵黄琼脂培养基、石蕊牛奶培养基、梭菌增菌培养基（青岛海博生物技术有限公司），生化鉴定管（青岛海博生物技术有限公司），引物合成（生工生物工程上海股份有限公司），PCR相关试剂（北京全式金生物技术有限公司），恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad生产）。

2 细菌的分离鉴定

2.1 病料接种

将病料接种在厌氧肉肝汤中，37℃厌氧培养18～24 h，培养过程中观察细菌是否生长和产气。同时将病料进行触片，革兰氏染色镜检，观察病料中细菌的形态特征。

2.2 分离培养

将厌氧肉肝汤中明显浑浊并有气体产生的菌液，在哥伦比亚血平皿上划线，血平皿放入厌氧罐37℃培养18～24 h。

挑取哥伦比亚血平皿上有细菌生长、并形成溶血环的单菌落，进行细菌涂片，革兰氏染色后镜检，观察细菌是否与病料触片染色镜检结果相同。镜检结果一致的菌落接种在梭菌增菌培养基中，37℃厌氧培养18～24 h，用作后续实验。

2.3 生化试验

生化鉴定参照伯杰细菌鉴定手册[10]，将上述菌液分别接种于新鲜制备的石蕊牛奶培养基、酪蛋白琼脂培养基、卵黄琼脂培养基中，并分别接种到吲哚、酯酶、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、水杨苷等生化鉴定管中，37℃培养，24 h，观察并记录实验结果。

2.4 16S rRNA的分子生物学鉴定

取梭菌增菌培养基中的分离菌纯培养物，进行集菌，并采用煮沸法获得总DNA。采用细菌16S rRNA的通用引物进行扩增[11]，引物信息见表1。PCR反应体系，50 μl：DNA模板2 μl，2× Mix 25 μl，上、下有引物各1 μl ，ddH2O 21 μl。PCR反应体系94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物采用1%凝胶电泳检测，目的条带切胶回收，然后连接T载，连接后转化到Trans5α，挑选阳性菌送“生工生物工程（上海）股份有限公司”测序。并在GenBank中进行比对。

3 结果

3.1 分离菌菌落形态及培养特性

细菌在哥伦比亚血平皿上可见菌落凸起，呈圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落周围有明显的溶血环。细菌厌氧生长，在厌氧肉肝汤中生长迅速，产生大量气体，培养基混浊。

3.2 分离菌菌体形态

挑取哥伦比亚血平皿上形成溶血环的单菌落进行涂片，用革兰氏染色，镜下见革兰氏阳性细菌，单个或成双存在，两端钝圆，形态粗短，无鞭毛。病料触片染色结果与哥伦比亚血液琼脂平板上有溶血环的菌落的菌体形态一致。

3.3 分离菌的生化试验

该分离菌接种到石蕊牛奶培养基中，表现为明显的“汹涌发酵”。其余生化试验结果见表2。

3.4 16S rRNA 分子生物学鉴定结果

以分离菌总DNA为模板扩增得到的PCR产物进行1%凝胶电泳，结果显示与预期大小1300 bp一致，见图1。将PCR产物回收连接T载体后转化到Trans5α进行测序，结果表明该分离菌的16S rRNA序列得到了有效扩增，序列比对结果显示分离株与产气荚膜梭菌XJWB01（GenBank登 录 号：KX094441.1） 和KSJ-23（GenBank登录号： MG462900.1），同源性均为99.47%。表明分离菌为产气荚膜梭菌。

4 小结及讨论

本研究通过临床症状的初步判定并进行病原菌的分离培养、生化试验、分子生物学试验，成功分离得到西藏那曲市牦牛源产气荚膜梭菌1株。

表1 16S rRNA生物学鉴定引物

表2 分离菌生化实验结果

图1 16S rRNA特异性鉴定

产气荚膜梭菌是一种梭状芽孢杆菌属的条件性致病菌，同时也是动物肠道中的正常菌群之一[1-3]，动物机体的抵抗力一旦下降，可致使肠道内的产气荚膜梭菌大量增殖产生外毒素，外毒素能使肠壁通透性增加，而后细菌和毒素就会透过肠壁，进入血液，从而引起毒血症或者败血症，实质性器官则受损严重［12］。本研究从采集的实质性器官和小肠中均分离到了产气荚膜梭菌，基本可以确诊牦牛的死亡由该病原菌引起。

该菌是人兽共患传染病原，能引起人类食物中毒和创伤性气性坏疽。人类、畜禽以及土壤、污水中最常见的产气荚膜梭菌是A型产气荚膜梭菌[13]，也有研究发现，A型产气荚膜梭菌是牛的“猝死症”的主要病原之一[14]。同时A型和B型产气荚膜梭菌能引起牛的肠毒血症病。但近几年，D型梭菌导致的牛肠毒血症呈上升趋势[15]，国外则多见C型和D型产气荚膜梭菌[16]。国内也有学者报道E型产气荚膜梭菌能感染牦牛，引起一系列疾病[17]。本次分离得到的1株牦牛源产气荚膜梭菌具体是何种毒素型，有待进一步研究。

临床上，应提高对该病的重视，有条件的可以进行相应的疫苗预防。对于患病牦牛，应及时进行隔离治疗，主要是镇静、消炎和强心。对于死亡牦牛要严格进行无害化处理，同时要注意场地的消毒。