西藏班戈县牦牛源肠产毒性大肠杆菌的毒力基因检测

卓 玛，赵燕娟，王 刚，索朗斯珠，扎西次仁

（1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市班戈县农牧科学技术服务站，西藏 那曲 852500）

大肠杆菌(Escherichia coil,E.coil)是埃希菌属中最为主要的细菌，属于革兰氏阴性兼性厌氧短杆菌，是人和牛等温血动物肠道内的一种正常菌群，对人和动物都有致病性，是目前危害并影响西藏地区牦牛生产的主要疾病之一。现将其分为6类，即肠产毒素大肠埃希菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)、肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希菌(ESIES)[1-3],其中ETEC是一类引起人和幼畜（犊牛、羔羊、初生仔猪）腹泻的重要病原菌[4]，出生幼畜被ETEC感染后常因严重腹泻、脱水而导致死亡，致死率很高，给西藏地区牦牛生产的工作带来极大的不便[1]。目前，国际上有不少关于ETEC毒素及分型的相关研究报道，但对西藏地区牦牛源大肠杆菌的毒力基因方面报道较少见。随着科技的日益发展、人们的经济来源的增多以及生活水平的提高，人们对食物的要求也迅速提高，从以前量的需求到现在发展为不仅要量也追求质的要求，因此，牦牛肉就成为人们极为喜欢的食物，但大肠杆菌病已成为牛群最重要的疾病之一，其感染率越来越高、发病率越来越高，导致死亡率也就越来越高，给牦牛业以及相应养殖业的发展带来了极为严重的危害，严重影响了养殖业的经济效益。因此，本试验选取西藏班戈县高寒生态奶牛厂的幼畜和成年牦牛的腹泻粪样及肛门拭子进行研究，主要是了解西藏牦牛源大肠杆菌毒力及毒力基因的分布情况，为西藏牦牛源大肠杆菌病的预防以及用药提供相应科学依据，以便参考。

1 材料

1.1 试验病料

本试验于2018年8月份从西藏班戈县无菌采集了90份腹泻粪样和肛门拭子。

1.2 检测试剂

氯霉素、诺氟沙星、万古霉素、头孢唑啉、链霉素、青霉素、丁胺卡那、四环素、阿奇霉素、复方诺明、红霉素等14种药敏片及普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美兰培养基均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 主要仪器

隔水式电热恒温培养箱、DZF-6021型真空干燥箱均购自北京市六一仪器厂；AB204-N型电子分析天平购自上海医用核子有限公司；SW-CJ-JC超净工作台，购自苏州净化设备公司；4S Red plus、PCR试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 方法

2.1 细菌的分离与培养

将采集的90份样品加入适量的营养肉汤培养基中，分离培养时在无菌超净工作台中用接种环采用划线法划线接种在相应的普通琼脂培养基、普通麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂的平板上，接种时因注意接种环的温度不宜过高，以免杀死病原菌，接种完后，将其培养基倒置在37℃恒温培养箱中进行过夜培养[5]。

2.2 引物设计

参考基因库所录的肠产毒性大肠杆菌毒力基因序列，用DNA 序列软件找出保守序列，采用Primer 5设计引物[6-7]（表1），由上海生物工程有限公司合成。

2.3 PCR检测

反应条件及相应的反应体系参照文献[8]，反应结束后5μl PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2.4 生化试验

按参照文献[9]，进行15项生化试验。将试验菌株分别接种于各个生化管中，37℃、24～48 h培养，观察并记录结果。

2.5 药物敏感性试验

将试验菌株用移液枪各吸取1 000μl置于营养琼脂培养基中，并用涂菌棒涂抹均匀，标号。将购买的14种抗生素药敏片按区域分别贴于培养基中，倒置放于37℃恒温箱中培养24 h后观察。 药敏试验按照CLS推荐的K-B法进行。抑菌结果可根据NCCLS(2013)公布的标准以敏感、中 介、耐 药 3 种形式对抑菌圈的大小作出标准的判定[10]（表2）。

3 结果

3.1 细菌的分离培养与鉴定

本试验菌株在麦康凯培养基上生长出粉红色的单一菌落；在普通培养基上长出无色单一的菌落，边缘整齐、稍凸起、光滑并兼湿润；在伊红美兰培养基上长出黑色带金属光泽的单一菌落；染色镜检为粉红色、短杆状、两端钝圆，结果见图1、图2。

图1 麦康凯琼脂培养基上的菌落形态

图2 部分菌株染色镜检图

3.2 生化试验

生化试验结果显示：6株疑似肠产毒性大肠杆菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖均能产酸并产气；吲哚、硫化氢、硝酸盐、明胶、M-R试验均为阳性；肌醇、山梨醇、V-P、柠檬酸、尿素试验均为阴性，结果详见表5，由表可知本试验分离菌株的生化特性与相关文献报道基本保持一致[11]。结果见表3。

表1 肠产毒性大肠杆菌毒力基因PCR扩增及测序所用引物

表2 药敏试验判定标准

表3 生化试验结果

3.3 肠产毒性大肠杆菌的毒力分型鉴定

对疑似牦牛源肠产毒性大肠杆菌22对毒力基因进行引物检测时，只检出两对（STP和CS8）毒力基因，共检测出6株肠肠毒素性大肠杆菌，其检出率均为33.33% ，检测结果见图3。

图3 CS8基因及stp基因重组质粒鉴定的电泳图

3.4 药物敏感性试验结果

药敏试验结果显示：6株肠产毒性大肠杆菌除了对青霉素和红霉素不敏感外，其余药物均为高度敏感[12]，见表4、表5。

4 讨论与分析

本研究对西藏班戈县散养牦牛牛群的病料进行了细菌的分离鉴定，通过麦康凯琼脂培养基跟伊红美兰琼脂培养基的培养特性与大肠杆菌特性基本相同的情况下做出初步确定。且本菌通过革兰氏染色观察得阴性菌，中等大小的杆菌，菌体两端钝圆，散在或单个存在；通过生化试验再次证明本试验菌株符合大肠杆菌的生化特性。因此，本试验6株病原菌的培养鉴定、革兰氏染色特点、生化特性的结果均符合大肠杆菌的分离培养特性，与相关文献报道相符。

PCR检测结果显示：对疑似牦牛源肠产毒性大肠杆菌22对毒力基因进行引物检测时，检测出两对（STP和CS8）毒力基因，共检测出6株肠肠毒素性大肠杆菌，检出率均为33.33% 。此检测结果与相应的文献报道相符。

表4 常用的14种抗生素的药敏片法抑菌结果

表5 6株牦牛源肠产毒性大肠杆菌对14种抗生素的药敏试验结果

药物敏感性分析试验表明：在14种常用的抗菌药物（氯霉素、诺氟沙星、万古霉素、头孢唑、链霉素、青霉素、丁胺卡那、四黄素、阿奇霉素、复方诺明、红霉素、呋喃妥因、庆大霉素、头孢西丁）中，病原菌对青霉素和红霉素不敏感，造成这样的主要原因可能是因为青霉素和红霉素在临床上广泛应用使细菌产生了耐药性。除了对青霉素不敏感外，其余药物均为高度敏感。由此表明，西藏班戈县应加大对大肠杆菌病的重视，临床诊断及治疗时，一定要根据具体条件并结合药敏试验合理选药，尤其是肠产毒素性大肠杆菌菌株的毒力相当强，一旦引发此病必定会造成重大的经济以及各方面的损失。通过药敏试验为保护班戈县牦牛生态厂牦牛大肠杆菌病的防治提供了有利的依据，更重要的是为西藏牦牛源肠产毒性大肠杆菌的预防及防治措施提供了相应的科学依据[13]。

当动物机体抵抗力下降的情况下方可引起犊牛及成年牦牛的发病。因此，除了定期注射疫苗外，还要加强对牦牛的饲养管理、加强检疫，其最主要的是维护动物并提供自身所需的营养物质，使机体各项指标处于平衡状态，此法对预防和控制大肠杆菌病的发生有一定的科学意义[10-15]。

本次试验从严重腹泻的牦牛粪便及肝门试子中分离到了产毒素性大肠杆菌，对其进行药敏试验,因此发生该病时，应该选择对此菌敏感的药物进行治疗。临床用药时应有针对性，应该根据药物敏感性试验结果选择对此菌敏感的药物进行治疗，乱用或滥用抗生素药物，会造成一些不良反应，如过敏反应，不仅容易导致临床耐药菌株的增多，会造成治疗的不完善及失败，而且随之大肠杆菌耐药菌株的增多，给临床用药带来了极大的困难。曾有学者提出牦牛中带耐药菌株的大肠杆菌可以通过动物的饲料和牦牛肉食品的加工逐渐感染到人的体内，兽医临床耐药菌株的不断增多可能是就是造成人医潜在的威胁。牦牛绿色食品正受到临床滥用抗生素的威胁，所以通过药敏试验结果合理选用药是当务之急[16]。