罗 洽 孙 娟 陈永梅
三明市第二医院消化内科,福建省永安市 366000
慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)在我国发病率较高,其由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染,传染性强、严重危害人类身心健康(病情迁延不愈可发展为肝硬化,甚至肝癌)。流行病学调查显示:在我国60%肝硬化、80%肝癌的病因为HBV感染[1],严重危害居民健康与生活质量[2]。目前对于CHB病情进展的原因仍不明确,有报道称细胞免疫功能紊乱与免疫细胞调节是CHB进展与预后的重要因素[3],而T淋巴细胞亚群为机体免疫功能状态的重要指标。维生素D是一类脂溶性维生素,钙磷调节为其经典的生理作用,而近些年发现其具有抗细胞增殖、抗纤维化、免疫调节、抗炎症等多种作用,缺乏可增加多种疾病的发生风险[4]。张利娟等[5]研究发现:CHB血清内25-羟维生素D3[25(OH)D3]水平较正常人明显下降,且下降程度与肝脏纤维化进展相关。因此,本课题组通过检测CHB患者血清25(OH)D3及外周血T淋巴细胞亚群分布情况,旨在探讨25(OH)D3与T淋巴细胞亚群的关系。
1.1 一般资料 选取2016年1月—2018年6月入住我院消化内科经相关检查诊断为慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的患者100例为观察组,其中男49例,女51例,年龄22~64岁,平均年龄(48.91±11.27)岁,平均BMI为25.20±4.11;同时选取同期我院门诊健康体检者100例作为对照组,其中男54例,女46例,年龄27~68岁,平均年龄(48.39±12.54)岁,平均BMI为25.33±4.18。两组实验对象在年龄、性别、BMI等方面差异无统计学意义(均P>0.05)。纳入标准[6]:CHB诊断参照慢性乙型肝炎防治指南(2015版):即乙肝表面抗原(HBsAg)和(或)乙肝病毒DNA(HBV-DNA)阳性超过6个月,谷丙转氨酶(ALT)持续或反复升高,或存在肝组织学病变。排除标准:(1)合并其他病毒性肝炎(甲肝、丙肝、戊肝、丁肝)、自身免疫性肝病、酒精性肝炎、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝等;(2)已出现肝脏纤维化或肝硬化、肝脏肿瘤等;(3)合并严重心、肾、血液系统疾病,恶性肿瘤,风湿性疾病,肺纤维化等;(4)曾接受免疫抑制剂、维生素D、抗乙肝病毒治疗者;(5)孕妇及哺乳期妇女。两组入组对象均签署知情同意书,并均经医院医学伦理委员会批准。
1.2 实验方法
1.2.1 血清25(OH)D3水平检测 。 两组试验对象均禁食8h以上抽取空腹右侧肘静脉血5ml,室温静置半小时,送检验科,离心(3 000r/min,离心15min),采用全自动电化学发光分析仪测定血清25(OH)D3水平,试剂盒由德国罗氏公司提供。25(OH)D3营养状态的判定标准:25(OH)D3<20ng/ml为缺乏,20ng/ml≤25(OH)D3≤30ng/ml为不足,25(OH)D3>30ng/ml为充足[7]。根据血清25(OH)D3水平,将100例CHB患者分成3组:25(OH)D3充足组22例、25(OH)D3不足组41例、25(OH)D3缺乏组37例。3组患者在年龄、性别、病程、肝功能Child-Pugh评分等基线资料方面差异均无统计学意义(均P>0.05)。
1.2.2 外周血T淋巴细胞亚群检测。抽取各外周静脉血5ml,采用德国Partec流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+T淋巴细胞)分布,同时分析不同25(OH)D3水平组T淋巴细胞亚群分布情况。
1.2.3 乙肝两对半、HBV-DNA检测。 采用全自动电化学发光法测定入院对象乙肝血清学标志物,主要包括乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝核心抗体、乙肝E抗原(HBeAg)、乙肝E抗体,根据CHB患者血清25(OH)D3水平分组,统计各组HBeAg阳性例数;采用实时荧光定量PCR检测CHB患者HBV-DNA载量水平,并统计不同25(OH)D3水平组HBV-DNA载量水平变化。
2.1 对照组和观察组一般资料对比 (1)与对照组比较,观察组患者血清25(OH)D3水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)与对照组比较,观察组外周血CD8+比例均升高,而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
表1 对照组和观察组一般资料比较
2.2 不同25(OH)D3组T细胞亚群、HBV-DNA水平对比 (1)随着25(OH)D3水平降低,CHB患者外周血CD8+比例逐渐升高,而CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例均逐渐降低,差异有统计学意义(均P<0.01)。(2)随着血清25(OH)D3水平降低,CHB患者HBeAg阳性率、HBV-DNA载量均逐渐升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。见表2。
2.3 CHB患者血清25(OH)D3与T淋巴细胞亚群、HBV-DNA的相关性分析 结果显示:CHB患者血清25(OH)D3与外周血CD8+细胞比例、HBV-DNA水平呈明显负相关(r分别为-0.688、-0.812,均P<0.01),与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例呈明显正相关(r分别为0.721、0.772、0.639,均P<0.01)。见表3。
表2 不同25(OH)D3组T细胞亚群、HBV-DNA水平比较
表3 CHB患者血清25(OH)D3与T细胞亚群、HBV-DNA的相关性分析
维生素D属脂溶性维生素, 25(OH)D3为其在体内的活性形式,其除钙磷调节作用外,研究发现[8]:其还具有免疫调节、抗纤维化,与慢性肝病的发生、发展相关。而慢性肝病普遍存在25(OH)D3不足或缺乏,Farnik等研究亦发现[9]:CHB患者25(OH)D3较正常对照组明显下降,其缺乏率高(达81%),且25(OH)D3水平与乙肝病毒载量呈显著负相关。而本课题组研究发现:CHB患者血清25(OH)D3水平较健康体检者明显降低,且其血清25(OH)D3不足及缺乏率高达78.0%(78/100),这与Farnik等结果基本一致,进一步证实CHB患者普遍存在维生素D缺乏。HE等人研究发现[10]:对于CHB患者,随着血清25(OH)D3水平降低,其血HBV-DNA载量反而呈明显升高趋势。本课题组将CHB患者根据25(OH)D3水平高低进行分组发现:随着血清25(OH)D3水平降低,CHB患者HBeAg阳性率、HBV-DNA载量水平均逐渐升高,差异有统计学有意义(均P<0.01),这说明CHB患者血清25(OH)D3水平与HBV-DNA载量可能存在相关性,进一步采用Pearson相关分析显示:血清25(OH)D3水平与HBV-DNA载量存在明显负相关(r=-0.812,P<0.01)。这与国内外相关研究结果基本一致[11-12]。
乙型肝炎病毒(HBV)感染发生率高,机体感染HBV后,肝脏损害一方面是由于HBV直接损伤肝细胞,而免疫损伤却是对疾病的发生、发展起决定作用。T淋巴细胞亚群在免疫调节中起重要作用,而CD3+、CD4+、CD8+作为T淋巴细胞亚群的重要组成部分,其在免疫调节功能中起重要作用[13]。有研究发现[14]:维生素D可以通过减少CD4+T细胞的增殖、分化,提高调节性T细胞的活性,从而参与机体的免疫调节。本课题组研究发现:与正常对照组比较,CHB患者外周血CD8+细胞比较升高,而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例均降低,与樊海燕等[15]研究结果一致,说明CHB患者机体免疫功能被打破,免疫损伤为参与CHB的发生过程。进一步根据CHB患者血清25(OH)D3水平高低进行分组,发现随着血清25(OH)D3水平降低,外周血CD8+细胞水平逐渐升高,而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例逐渐降低,且相关性分析亦提示CHB患者血清25(OH)D3水平与CD8+细胞比例呈明显负相关(r=-0.688,P=0.004),与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明显正相关(r分别为0.721、0.772、0.639,均P<0.01)。这说明维生素D可能与细胞免疫存在相关性,其可能参与了CHB患者免疫损伤调节过程。这为临床上治疗CHB患者提供了新的理论基础。
综上所述,CHB患者25(OH)D3不足及缺乏率高,其外周血CD8+比例升高,而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低,且血清25(OH)D3水平与HBV-DNA、外周血CD8+细胞比例呈明显负相关,与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明显正相关。然而,由于课题经费受限,本课题组亦存在不足,即未进一步探讨维生素D参与CHB免疫调节的机制。下一步本课题组将从基因水平、蛋白水平及细胞通路水平探讨其机制,并拟探讨外源性补充维生素D是否可提高其抗病毒效果,延缓CHB病情进展。