慢性乙型肝炎患者血清25-羟维生素D3与外周血T淋巴细胞亚群的相关性研究

罗 洽 孙 娟 陈永梅

三明市第二医院消化内科，福建省永安市 366000

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)在我国发病率较高，其由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染，传染性强、严重危害人类身心健康(病情迁延不愈可发展为肝硬化，甚至肝癌)。流行病学调查显示：在我国60%肝硬化、80%肝癌的病因为HBV感染[1]，严重危害居民健康与生活质量[2]。目前对于CHB病情进展的原因仍不明确，有报道称细胞免疫功能紊乱与免疫细胞调节是CHB进展与预后的重要因素[3]，而T淋巴细胞亚群为机体免疫功能状态的重要指标。维生素D是一类脂溶性维生素，钙磷调节为其经典的生理作用，而近些年发现其具有抗细胞增殖、抗纤维化、免疫调节、抗炎症等多种作用，缺乏可增加多种疾病的发生风险[4]。张利娟等[5]研究发现：CHB血清内25-羟维生素D3[25(OH)D3]水平较正常人明显下降，且下降程度与肝脏纤维化进展相关。因此，本课题组通过检测CHB患者血清25(OH)D3及外周血T淋巴细胞亚群分布情况，旨在探讨25(OH)D3与T淋巴细胞亚群的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2018年6月入住我院消化内科经相关检查诊断为慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的患者100例为观察组，其中男49例，女51例，年龄22～64岁，平均年龄(48.91±11.27)岁，平均BMI为25.20±4.11；同时选取同期我院门诊健康体检者100例作为对照组，其中男54例，女46例，年龄27～68岁，平均年龄(48.39±12.54)岁，平均BMI为25.33±4.18。两组实验对象在年龄、性别、BMI等方面差异无统计学意义(均P>0.05)。纳入标准[6]：CHB诊断参照慢性乙型肝炎防治指南(2015版)：即乙肝表面抗原(HBsAg)和(或)乙肝病毒DNA(HBV-DNA)阳性超过6个月，谷丙转氨酶(ALT)持续或反复升高，或存在肝组织学病变。排除标准：(1)合并其他病毒性肝炎(甲肝、丙肝、戊肝、丁肝)、自身免疫性肝病、酒精性肝炎、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝等；(2)已出现肝脏纤维化或肝硬化、肝脏肿瘤等；(3)合并严重心、肾、血液系统疾病，恶性肿瘤，风湿性疾病，肺纤维化等；(4)曾接受免疫抑制剂、维生素D、抗乙肝病毒治疗者；(5)孕妇及哺乳期妇女。两组入组对象均签署知情同意书，并均经医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 血清25(OH)D3水平检测 。 两组试验对象均禁食8h以上抽取空腹右侧肘静脉血5ml，室温静置半小时，送检验科，离心(3 000r/min，离心15min)，采用全自动电化学发光分析仪测定血清25(OH)D3水平，试剂盒由德国罗氏公司提供。25(OH)D3营养状态的判定标准：25(OH)D3<20ng/ml为缺乏，20ng/ml≤25(OH)D3≤30ng/ml为不足，25(OH)D3>30ng/ml为充足[7]。根据血清25(OH)D3水平，将100例CHB患者分成3组：25(OH)D3充足组22例、25(OH)D3不足组41例、25(OH)D3缺乏组37例。3组患者在年龄、性别、病程、肝功能Child-Pugh评分等基线资料方面差异均无统计学意义(均P>0.05)。

1.2.2 外周血T淋巴细胞亚群检测。抽取各外周静脉血5ml，采用德国Partec流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+T淋巴细胞)分布，同时分析不同25(OH)D3水平组T淋巴细胞亚群分布情况。

1.2.3 乙肝两对半、HBV-DNA检测。 采用全自动电化学发光法测定入院对象乙肝血清学标志物，主要包括乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝核心抗体、乙肝E抗原(HBeAg)、乙肝E抗体，根据CHB患者血清25(OH)D3水平分组，统计各组HBeAg阳性例数；采用实时荧光定量PCR检测CHB患者HBV-DNA载量水平，并统计不同25(OH)D3水平组HBV-DNA载量水平变化。

2 结果

2.1 对照组和观察组一般资料对比 (1)与对照组比较，观察组患者血清25(OH)D3水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。(2)与对照组比较，观察组外周血CD8+比例均升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 对照组和观察组一般资料比较

2.2 不同25(OH)D3组T细胞亚群、HBV-DNA水平对比 (1)随着25(OH)D3水平降低，CHB患者外周血CD8+比例逐渐升高，而CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例均逐渐降低，差异有统计学意义(均P<0.01)。(2)随着血清25(OH)D3水平降低，CHB患者HBeAg阳性率、HBV-DNA载量均逐渐升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

2.3 CHB患者血清25(OH)D3与T淋巴细胞亚群、HBV-DNA的相关性分析 结果显示：CHB患者血清25(OH)D3与外周血CD8+细胞比例、HBV-DNA水平呈明显负相关(r分别为-0.688、-0.812，均P<0.01),与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例呈明显正相关(r分别为0.721、0.772、0.639，均P<0.01)。见表3。

表2 不同25(OH)D3组T细胞亚群、HBV-DNA水平比较

表3 CHB患者血清25(OH)D3与T细胞亚群、HBV-DNA的相关性分析

3 讨论

维生素D属脂溶性维生素， 25(OH)D3为其在体内的活性形式,其除钙磷调节作用外，研究发现[8]：其还具有免疫调节、抗纤维化，与慢性肝病的发生、发展相关。而慢性肝病普遍存在25(OH)D3不足或缺乏，Farnik等研究亦发现[9]：CHB患者25(OH)D3较正常对照组明显下降，其缺乏率高(达81%)，且25(OH)D3水平与乙肝病毒载量呈显著负相关。而本课题组研究发现：CHB患者血清25(OH)D3水平较健康体检者明显降低,且其血清25(OH)D3不足及缺乏率高达78.0%(78/100)，这与Farnik等结果基本一致，进一步证实CHB患者普遍存在维生素D缺乏。HE等人研究发现[10]：对于CHB患者，随着血清25(OH)D3水平降低，其血HBV-DNA载量反而呈明显升高趋势。本课题组将CHB患者根据25(OH)D3水平高低进行分组发现：随着血清25(OH)D3水平降低，CHB患者HBeAg阳性率、HBV-DNA载量水平均逐渐升高，差异有统计学有意义(均P<0.01),这说明CHB患者血清25(OH)D3水平与HBV-DNA载量可能存在相关性，进一步采用Pearson相关分析显示：血清25(OH)D3水平与HBV-DNA载量存在明显负相关(r=-0.812，P<0.01)。这与国内外相关研究结果基本一致[11-12]。

乙型肝炎病毒(HBV)感染发生率高，机体感染HBV后，肝脏损害一方面是由于HBV直接损伤肝细胞，而免疫损伤却是对疾病的发生、发展起决定作用。T淋巴细胞亚群在免疫调节中起重要作用，而CD3+、CD4+、CD8+作为T淋巴细胞亚群的重要组成部分，其在免疫调节功能中起重要作用[13]。有研究发现[14]：维生素D可以通过减少CD4+T细胞的增殖、分化，提高调节性T细胞的活性，从而参与机体的免疫调节。本课题组研究发现：与正常对照组比较，CHB患者外周血CD8+细胞比较升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例均降低，与樊海燕等[15]研究结果一致，说明CHB患者机体免疫功能被打破，免疫损伤为参与CHB的发生过程。进一步根据CHB患者血清25(OH)D3水平高低进行分组，发现随着血清25(OH)D3水平降低，外周血CD8+细胞水平逐渐升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞比例逐渐降低，且相关性分析亦提示CHB患者血清25(OH)D3水平与CD8+细胞比例呈明显负相关(r=-0.688，P=0.004)，与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明显正相关(r分别为0.721、0.772、0.639，均P<0.01)。这说明维生素D可能与细胞免疫存在相关性，其可能参与了CHB患者免疫损伤调节过程。这为临床上治疗CHB患者提供了新的理论基础。

综上所述，CHB患者25(OH)D3不足及缺乏率高，其外周血CD8+比例升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低，且血清25(OH)D3水平与HBV-DNA、外周血CD8+细胞比例呈明显负相关，与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明显正相关。然而，由于课题经费受限，本课题组亦存在不足，即未进一步探讨维生素D参与CHB免疫调节的机制。下一步本课题组将从基因水平、蛋白水平及细胞通路水平探讨其机制，并拟探讨外源性补充维生素D是否可提高其抗病毒效果，延缓CHB病情进展。