银叶菊总黄酮含量测定

暨迪军,刘明珠,李成思,卢永昌

（1.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；3.青海省现代藏药创制工程技术中心，青海 西宁 810007）

银叶菊原产于地中海沿岸，为菊科千里光属的多年生草本植物[1]，含有大量的黄酮类化合物，且有抗炎、抗菌及抗病毒的功效[2]，还具有预防癌症、抗衰老、增强机体免疫力以及降低心血管疾病等药理活性[3]。目前对于银叶菊中总黄酮的测定未见报道。本研究以芦丁为标准品，通过紫外分光光度法测定银叶菊中总黄酮的含量，为银叶菊的化学成分及其质量控制的进一步研究提供科学依据。

1 原料、仪器与试剂

1.1 原料

试验药材：银叶菊，2016年8月采自青海省玉树州，由青海民族大学林鹏程教授鉴定为银叶菊（Senecio cineraria）。

1.2 仪器

AL 204 型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KQ-300B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ；DFY-200C 粉碎机(上海谷宁实业有限公司)。

1.3 试剂

芦丁标准品（批号：20040412，上海润捷化学试剂有限公司）；甲醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

2 实验方法与结果

2.1 样品的处理

取银叶菊，晒干粉碎后过80 目筛备用。

2.2 样品溶液的制备

称取银叶菊粉末1.0 g，在55 ℃下用25 mL 50%甲醇超声55 min，并将提取液定容于50 mL 容量瓶中。

2.3 对照品溶液的配制

称取芦丁对照品，加适量甲醇溶液超声溶解，冷却后移入容量瓶，并用甲醇溶液定容。

2.4 紫外分光光度法测定银叶菊总黄酮显色方法

实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系吸光光度法。取10 mL 容量瓶，加入样品溶液1 mL，加适量甲醇，再加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6 min 后加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液；静置6 min 后加入2.5 mL 10%氢氧化钠显色液，摇匀，用甲醇溶液定容。静置20 min 后测其吸光度。参比溶液为试剂空白液，检测波长为510 nm。

以下过程按此方法进行。

2.5 标准曲线的绘制

吸取0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL 芦丁对照品分别置于6 只10 mL 容量瓶中，测定吸光度。以芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线，得到线性回归方程式为：A=6.721C+0.008,R=0.999 8，线性范围0.03 ～ 0.15 mg。

2.6 银叶菊总黄酮的提取及提取率测定

称取银叶菊干粉1.0 g，加入25 mL 锥形瓶中，测其吸光度。根据公式C=(A-0.0008)÷6.721×50×10÷1000 计算样品的总黄酮浓度。

3 结果与分析

以单因素试验为基础，选择甲醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为影响因素，采用选择L9(34)正交试验[4]，确定最佳提取工艺，因素水平见表1，试验分析结果见表2。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验结果直观分析表

由表2分析可得：提取温度对总黄酮提取率的影响最大，其次是料液比，然后是甲醇浓度，影响程度最低的是提取时间。银叶菊中总黄酮含量最佳提取条件为用45%甲醇在55 ℃温度下用1∶25的料液比每次提取45 min。

分别称取5 份银叶菊样品，采用确定的最佳提取工艺，得出银叶菊中总黄酮含量平均值为2.09%±0.66%。说明确定的提取条件较优。

4 方法学验证

4.1 精密度实验

取6 个10 mL 容量瓶，移入定容后的提取液，静置20 min后测量，计算得RSD值为1.16%。

4.2 加标回收率实验

在已经测定出含量的6份银叶菊总黄酮提取液中，分别加入2 mL 芦丁配置好的对照品，测定并计算平均回收率结果为99.25%，RSD值为1.27%，以此说明测定银叶菊总黄酮含量用该方法是可行的。

4.3 稳定性实验

移液管吸取2 mL 银叶菊提取液，初次显色后放置15 min 后，待检测器系统稳定后测定吸光度。每间隔1 h 后，测定一次黄酮提取液吸光度，实验结果证实吸光度在5 h 内无明显变化，表明该显色反应溶液在5 h内稳定性良好。

5 实验结果与讨论

实验结果显示银叶菊总黄酮含量在55 ℃下用45%甲醇在1∶25 的料液比中超声55 min 时有最大值2.10%。

本实验采用紫外分光度法对银叶菊中总黄酮含量进行了测定，经过方法学验证证实该方法具有良好的重复性和稳定性。