采用全自动在线固相萃取-高效液相色谱法检测畜禽产品中氟喹诺酮类药物残留量

程传民，达列亚，李 云，柏 凡，魏 敏，王宇萍，李 茂，樊淑娜

（1.四川省饲料工作总站，四川成都610041；2.新疆维吾尔族自治区兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐833000）

氟喹诺酮属于促旋酶抑制剂四个亚型中的一种，一般将氟喹诺酮称为二代喹诺酮。其常作为兽用药物，被广泛应用于食用动物。氟喹诺酮是广谱抗生素，对多种细菌有抑制作用，特别是针对牛、猪和鸡。由于此类药物的大量使用，致使动物产生抗药反应，欧盟委员会制定的法令（EEC）No 2377/90，规定了一些氟喹诺酮类药物的最大残留限量（MRLs）。因此建立一种多组分、经济、方便、灵敏度高的全自动在线固相萃取-高效液相色谱检测方法很有必要。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 在线固相萃取-高效液相色谱仪（美国Aglient 1260）；电子天平（0.01 mg，德国赛多利斯公司）；涡旋振荡器（禾本森科有限公司）；电动振荡器（美国IKA公司）；高速冷冻离心机（Biofug PrimoR公司）。

1.1.2 材料 乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher Scientific公司）；乙酸（色谱纯，Fluka）；0.1%三氟乙酸（用三乙胺调pH=3.0）（色谱纯，CNW）；氟喹诺酮标准品（DR公司）。

标准品的配制：分别称取0.01 g（精确至0.1 mg）标准品置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，标准储备液浓度为1 mg/mL。将各标准储备液用20%乙腈溶液稀释，配成混合标准工作液，各组分浓度为10 mg/L，用20%乙腈溶液配制成目标药物浓度为1、2、5、10、50、100μg/L的混合标准系列溶液。

1.2 样品处理 称取均质畜禽产品样品2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入5 mL 1%乙酸乙腈（肉类加1 mL水，混匀后加4 mL 1%乙酸乙腈），涡旋提取2 min，在温度为4℃的条件下，10000 r/min离心5 min，上清液转入另一50 mL离心管中，重复提取一次。离心后合并上清液，加入20 mL正己烷，涡旋混合1 min，在温度为4℃的条件下，10000 r/min离心2 min，移去正己烷，取1 mL乙腈层到10 mL离心管中，加入4 mL水，过0.22μm滤膜后上机测定。

1.3 色谱条件 色谱柱：Aglient Eclipse XDBC18，规格150 mm×4.6 mm，粒径5μm，富集柱：C18的预柱。分析泵流速：1.0 mL/min；进样体积100μL；柱温为30℃。检测波长：激发波长280 nm；发射波长450 nm。分析泵流动相：A为0.1%三氟乙酸溶液（pH=3.0），B为乙腈溶液，流动相比例为A+B=88+12。运行时间35 min。上样泵流动相采用甲醇-水的二元溶液。采用溶剂梯度和流速梯度相结合的方式，具体见表1。阀切换：0～1 min：阀处于位置1，分析泵直接与分析柱联通，平衡色谱柱，上样泵将待处理的样品从自动进样器推到富集柱上进行富集和净化；1～2 min：阀处于位置2，分析泵与富集柱联通，将富集在柱头的待测样品反着冲到分析柱上进行分离分析，富集泵直接排废液；2 min以后：阀处于位置1，分析泵继续完成分离分析，富集泵与富集柱相连，冲洗并平衡富集柱，以备下一次上样。

表1 上样泵液相色谱梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择 本实验研究了甲醇-乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%三氟乙酸两种流动相对6种氟喹诺酮类药物分离度的影响，以甲醇-乙腈-0.1%三氟乙酸（5+8+87）为流动相时可以实现氟喹诺酮的基线分离，同时也可以多检测2种氟喹诺酮药物，增加的药物为氧氟沙星和沙拉沙星，当需要检测这两种氟喹诺酮时可采用此条件，但运行时间相当长，见图1a。以乙腈-0.1%三氟乙酸（12+88）为流动相时可以实现6种氟喹诺酮药物的分离，但诺氟沙星和氧氟沙星是完全没有分开的，由于氧氟沙星灵敏度相对较低，本研究选择做诺氟沙星，在样品检测时应注意药物的定性，色谱分离情况见图1b。

2.2 色谱柱的选择 本研究比较了Agilent poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm、Agilent SB-C18 2.1 mm×100 mm，1.8μm和Aglient Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5μm色 谱柱，使用标准工作液对各规格色谱柱性能进行考察。Agilent poroshell 120在流速为0.4 mL/min的情况下，各目标化合物可以达到基线分离，但运行时间要到50 min。Agilent SB-C18在流速为0.3 mL/min的情况下，各目标化合物分离度不是很理想，色谱峰的对称性也相对差一点，可能和本实验使用的色谱柱的柱效有较大关系。若使用上述两种色谱柱还需进一步改变色谱条件。Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱峰型和分离度可以满足本研究方法的要求，且一般实验室比较常见。

2.3 线性关系和检出限 将6种氟喹诺酮药物分别配制成质量浓度为1～100μg/L的系列标准溶液。采用本实验条件对系列标准溶液进行测定，以浓度X对所测物质的峰面积Y作图，得到线性方程以及线性相关系数。以实际可以检测出最低添加量为检出限。各目标化合物线性方程和检出限见表2。

2.4 样品测定 本实验对2个鸡蛋和2个鸡肉阳性样品进行检测，此检测结果与应用标准方法—鸡蛋和鸡肉中氟喹诺酮类药物及金刚烷胺残留测定操作细则（2018年全国例行检测使用的液质内标定量方法）的检测结果相对偏差小于8.0%，各目标化合物无杂质峰干扰，净化效果好，样品色谱图见图2。由此可见本实验方法与标准方法有较好的吻合，具体检测结果见表3。

图1 氟喹诺酮类药物标准色谱图

表2 6种氟喹诺酮药物的线性关系和检出限

图2 阳性样品色谱图（a：鸡肉,b：鸡蛋）

表3 阳性样品检测结果与使用标准方法检测结果对照

2.5 回收率和精密度实验 在3种不同类型空白试样中分别添加低水平和高水平2种剂量的氟喹诺酮药物。按照本实验方法进行加标回收实验，结果见表4。样品加标回收率（AR）为81.9%～106.8%。相对标准偏差（RSD）小于3.52%。该方法的回收率和重现性均较好。

表4 回收率实验结果（n=6）

3 结论

本实验建立了同时检测6种氟喹诺酮药物的全自动在线固相萃取-高效液相色谱法，无干扰杂质峰，净化效果较好。6种氟喹诺酮药物在35 min内实现了基线分离，其线性相关系数大于0.9980，6种氟喹诺酮平均回收率为81.9%～106.8%；相对标准偏差小于3.52%；定量限为2.5μg/kg。该方法操作简单、经济、灵敏度高，结果准确可靠。