两阶段调控优化保加利亚乳杆菌合成γ-氨基丁酸

王红波，陈国鑫，魏 蜜，刘智杰，陈禅友

（1.江汉大学生命科学学院，湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北武汉430056；2.湖北工程学院生命科学技术学院，特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感432000）

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降血压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑等生理功能（Kantachote等，2016）。GABA作为饲料添加剂，能够提高动物抗应激能力，改善胴体品质和提高生产性能（汪祥燕等，2016)。潘雪梅等（2018）研究发现，GABA可以缓解奶牛夏季的热应激，提高奶牛免疫能力和机体的抗氧化能力。Park等（2015）研究结果表明，GABA作为饲料添加剂能显著提高蛋鸡的生产能力，改善鸡蛋品质。常见的生产GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等，2017）。管军军等（2018）认为，乳酸菌是定植在动物肠道中的益生菌，有利于动物的肠道健康，常被用于制备发酵饲料，有助于动物的健康养殖。徐秀景等（2018）研究表明，乳酸菌发酵制备的固态发酵饲料，能够改善猪肉的品质，提高育肥猪的生长性能。乳酸菌与GABA的联合生产，能够显著改善饲料的营养品质。沈雪娇等（2018）研究发现，产GABA的短乳杆菌P-14发酵饲料应用于育肥猪的饲养，能提高其生产性能，改善猪肉的品质，提高饲料的报酬率。

保加利亚乳杆菌ATCC 11842是一种在食品加工领域重要的益生菌，在乳制品和功能饮料加工过程中已展现出良好的应用前景（毛雪等，2016）。在饲料加工领域，保加利亚乳杆菌ATCC 11842也具有良好的应用前景。本研究通过探索保加利亚乳杆菌ATCC 11842生物合成GABA的规律，为生产富含GABA的发酵饲料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 GABA标准品、MRS培养基和谷氨酸钠均购于北京酷来搏科技有限公司；苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸钠、氢氧化钠和无水乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司；保加利亚乳杆菌ATCC 11842保藏于江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心食品加工实验室。

1.2 仪器与设备 V-1600紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TG165型离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；HH-2型水浴锅：国华电器有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 菌体培养与GABA生物合成方法 菌体培养方法：保加利亚乳杆菌ATCC 11842活化培养基为MRS固体培养基，培养温度为30℃；保加利亚乳杆菌ATCC 11842生长培养基为MRS液体培养基，接种量为2%；生长液体培养基置于50 mL离心管，装液量为48 mL，调整液体培养基pH，控制培养温度，厌氧静置培养，培养36 h；每个样品重复3次。

GABA生物合成方法：在菌体生长液体培养基中添加0.25 g谷氨酸钠底物，调整液体培养基pH，控制培养温度，生物转化48 h；每个样品重复3次。

1.3.2 菌体生物量测定方法 定时取0.5 mL发酵培养基，6000 r/min离心15 min，弃上清液，用0.5 mL无菌水悬浮菌体，在600 nm条件下测定菌体光密度值（吴军林等，2018）。在600 nm波长条件下，绘制菌体生物量与光密度的标准曲线，从而计算出培养基中湿菌体的浓度。

1.3.3 GABA样品制备及其检测方法 GABA样品制备：取1 mL发酵液体培养基于1.5 mL离心管，6000 r/min离心10 min，得到的上清液用于GABA含量的检测。

检测方法：取0.3 mL上清液于25 mL离心管中；依次加入0.2 mL的0.2 M硼酸盐缓冲液（pH 9.0），1 mL的6%苯酚溶液，0.8 mL的5%次氯酸钠溶液，充分振荡混匀；置于沸水浴中保持10 min；然后迅速置于冰浴中保持15 min；剧烈振荡至显示蓝色；最后加入2 mL的60%乙醇溶液；在645 nm波长条件下检测光密度值（Zhang等，2014）。

2 结果与分析

乳酸菌生物转化谷氨酸钠生物合成GABA分为两个阶段。第一阶段为乳酸菌的生长阶段，在此阶段需要提供乳酸菌良好生长环境，使乳酸菌达到最大的生物量；第二阶段是GABA的生物合成阶段，在此阶段需要控制谷氨酸脱羧酶良好的活性环境，谷氨酸钠在谷氨酸脱羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等，2014）。Shi等（2017）研究表明用短乳杆菌静息细胞生物转化谷氨酸生成GABA有两个关键的控制因素，一是pH控制在4.5，二是温度控制在45℃。Peng等（2013）研究结果也表明分步控制温度和pH条件，用短乳杆菌CGMCC 1306生物转化谷氨酸能获得良好的转化效率。因此，本研究探索分两阶段分别控制菌株的生长和GABA的生物合成，以期提高GABA的产量。

2.1 pH和温度对菌株生长的影响 由图1可知，pH能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36 h时，pH为5、6、7、8、9时的菌体生物量分别为11.60、17.10、15.58、13.93、9.48 g/L。pH高于9时，菌株的生长受到显著抑制。pH为6时菌株的生长最佳。终产物乳酸的积累是抑制乳酸菌生长的重要原因，调节培养基初始pH会影响乳酸菌生长。闫征等（2003）研究表明，调节培养基初始pH，乳酸菌在pH 6和pH 6.5条件下，表现出较好的生长。杨静等（2017）的研究结果也表明，乳酸菌生长的最适pH为5.5～7.0。

由图2可知，温度能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36 h时，温度为25、30、35、40、45℃时的菌体生物量分别为13.60、15.44、16.90、15.62、5.40 g/L。温度高于45℃，菌株生长受到明显抑制。其中35℃是菌株生长的最佳温度。王奎明（2007）研究结果表明，保加利亚乳杆菌在MRS培养基中和37℃条件下生长良好。培养基组分也会影响保加利亚乳杆菌的最适培养温度。曾少葵等（2017）以牡蛎酶解液为原料，保加利亚乳杆菌的最适生长温度为40℃。

图1 不同pH条件下菌体生长曲线

2.2 pH和温度对GABA生物合成的影响 pH和温度会影响酶分子的活性结构以及酶分子与底物的结合（周文斯等，2018；陈稳等，2018）。调控反应的温度和pH对谷氨酸脱羧酶活性有重要影响，进而影响GABA的生物合成（Wu等，2018；时粲等，2016）。

保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS液体培养基中生长36 h时，培养基pH降为6.0，当添加0.25 g谷氨酸钠后，培养基pH变为4.5。在此基础上调整发酵液的pH分别至5、6、7、8、9，温度为35℃，生物转化48 h后，比较GABA的产量。由图3可知，pH能显著影响GABA的产量。在pH为5、6、7、8、9五个不同条件下GABA产量分别为3.25、3.30、3.75、5.0、3.71 g/L。其中pH为8时GABA生物合成量最高。随着菌株的生长，菌株产酸也会使发酵液的pH降低。孟丹等（2017）研究表明，乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH为6.5，其发酵液中γ-氨基丁酸的质量浓度为0.22 g/L。曾林等（2017）从四川泡菜中分离出一株具有产GABA能力的植物乳杆菌BC114，并对其发酵条件进行优化，结果表明，其最佳pH为5.50，GABA产量为3.82 g/L。

图2 不同温度条件下菌体生长曲线

图3 不同p H条件下GABA产量

由图4可知，温度能显著影响GABA的产量。在温度为25、30、35、40、45℃条件下的GABA产量分别为2.57、2.69、3.33、4.77、3.96 g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳温度。韩昱姝等（2017）从泡菜中筛选出一株短乳杆菌LF-fb-017，其GABA产量可达1.68 g/L，其最佳生物转化温度为37℃。Park等（2014）研究结果也表明，乳酸菌来源的谷氨酸脱羧酶最佳活性温度为41℃。

2.3 优化前后GABA产量的比较 参照前期研究方法，保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS培养基中生物转化谷氨酸钠合成GABA，在自然pH和恒温30℃条件下，GABA产量为2.36 g/L（Wang等，2019）。用两阶段调控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH 6.0，温度35℃条件下生长36 h，再调整发酵液pH至8.0，温度调整至40℃，生物转化48 h，GABA的产量达到5.98 g/L，如图5。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高了153.39%。张竺英等（2014）从豆豉中筛选的产γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，该菌株在含1%（W/W）谷氨酸钠的MRS发酵培养基中，37℃厌氧培养48 h后，发酵液中GABA产量达到0.161 g/L。史晓萌等（2017）从哈萨克族传统发酵食品中筛选出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA产量达329.81 mg/L。吴非等（2012）利用紫外线对GABA高产菌株保加利亚乳杆菌L2进行诱变处理，获得高产GABA突变菌株L2-4，其在含有1%L-谷氨酸改良MRS培养基中的GABA产量达到4.235 g/L。因此，保加利亚乳杆菌ATCC 11842 GABA的合成能力显著高于上述报道的乳酸菌株。

图4 不同温度条件下GABA产量

图5 优化前后GABA产量对比

3 结论

本试验结果表明，对菌株生长和GABA生物合成的pH和温度进行两阶段分开控制，能显著提高GABA的产量。菌株在初始pH 6.0，温度35℃条件下生长36 h后，再调整发酵液pH至8.0，温度40℃，GABA的产量达到5.98 g/L。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高153.39%。