新型饲草串叶松香草SOD提取条件优化及其抗氧化能力

郭云霞，高双喜，周秀平，张志儒，郝庆红，刘月琴，张英杰

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定071000；2.河北农业大学生命科学学院，河北保定071000；3.怀安县农牧局，河北张家口076150）

串叶松香草（Silphium perfoliatumL.）别名松香草，因能够连续收割10～12年 （娜日苏，2006），且叶蛋白质含量丰富，可作为一种高产优质的饲用植物加以利用，同时其还具有耐热、抗寒、耐盐碱、抗虫能力强等优点（王玮等，2004）。据报道，串叶松香草富含超氧化物歧化酶（SOD），其SOD活力为112.60 U/mL，仅次于葡萄干和大蒜（刘文海等，2008）。众多学者从串叶松香草的引种（刘生龙，1995）、应用价值及栽培要点（徐善光等，2010）、营养成分及价值分析（谭兴和等，2003）、饲喂效果（赵明坤等，2001）及水提液体外抗氧化活性（张薇，2012）、不同生育期营养成分变化及瘤胃降解动态（聂芙蓉，2009）等方面进行了研究。但是，目前对串叶松香草药用价值的探索及不同时期的合理运用仍不完善，且对其不同发育期类SOD活性及抗氧化能力的研究报道较少。本试验对大叶期和开花期的串叶松香草进行提取，并对其类SOD含量及抗氧化成分的测定，初步确定串叶松香草的适宜收获期及为牧草资源的合理利用提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料 叶丛期和开花期串叶松香草样品，采集于保定地区中赢自然（北京）农业科技发展有限公司串叶松香草种植基地。

1.2 试验方法

1.2.1 SOD活性测定 将张薇（2012）方法进行改进测定串叶松香草中SOD活性，即邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，加入含有SOD活性的物质抑制邻苯三酚自氧化速率以确定其SOD活性。制备A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（含1 mol/L EDTA-Na2）；B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。

邻苯三酚自氧化速率（△A）的测定：25℃水浴中，于10 mL比色管中依次加入A液2.35 mL，蒸馏水2.00 mL，预热20 min后，加入B液0.15 mL。混合均匀后立即检测，以A液调零，在325 nm波长下分别测定初始和1 min后吸光值，两者之差即为△A。

样液抑制邻苯三酚自氧化速率（△A′）的测定：按照上述方法，在加B液之前加入不同剂量的样液，以确定最佳的1/2△A抑制率，最终确定样液加入量为20.0μL，加入B液混合均匀后立即检测，以A液调零，在325 nm波长下分别测定初始和1 min后吸光值，两者之差即为△A′。根据公式计算样品酶活：

SOD活 力/（U/g）=（△A-△A′）/△A×100%/50%×V0×D/V×V1/m；

式中：△A为邻苯三酚自氧化速率；△A′为样液抑制邻苯三酚自氧化的速率；V为加入样液的体积，mL；V0为反应液总体积，mL；V1为样液总体积，mL；D为样液的稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.2 串叶松香草水提液最适提取条件优化

1.2.2.1 单因素试验分析 将新鲜的串叶松香草样品置于恒温干燥箱中，105℃15 min，65℃4 h干燥至恒重后，粉碎过40目筛，并密封放于阴凉干燥处备用。用双蒸水为串叶松香草的提取溶剂，以SOD活性为标准，进行单因素试验分析。分别对提取时间、提取料液比、提取温度进行确定。

提取时间的确定：称取串叶松香草粉1 g，加入10 mL双蒸水混匀，密封置于室温下分别于2、4、6、8、10、12、24 h时对提取液进行SOD活性测定，确定最佳提取时间。

料液比的确定：称取串叶松香草粉1 g，加入10 mL双蒸水混匀，密封。料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以最佳提取时间，对提取液进行SOD活性测定，确定适宜料液比。

提取温度的确定：称取串叶松香草粉1 g，以最佳料液比和最佳提取时间进行检测，置于37、4℃和18℃进行提取，对提取液进行SOD活性测定，最终确定提取温度。

1.2.2.2 提取条件正交试验优化 以单因素试验结果为依据，选取提取时间、料液比、提取温度为自变量，以SOD活性为测定值，设计三因素两水平的正交分析试验（表1、表2）。

表1 大叶期提取条件正交试验设计L4（23）

表2 开花期提取条件正交试验设计L4（23）

1.2.3 类SOD成分含量测定

1.2.3.1 串叶松香草中维生素C含量测定 用紫外分光光度法测定串叶松香草中维生素C（VC）的含量，即根据VC在稀酸溶液中，于245 nm波长处有最大吸收的特性测定VC的含量。

标准曲线的绘制：准确称取经110℃干燥至恒重的抗坏血酸0.010 g，加入10%HCl溶液2 mL后用蒸馏水定容至100 mL，混匀得到浓度为100μg/mL的标准抗坏血酸溶液。梯度量取上述标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支10 mL具塞比色管中，用蒸馏水定容至刻度。以抗坏血酸空白调零，在245 nm处测定吸光值，并以标准抗坏血酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制抗坏血酸标准曲线。

VC标 准 曲 线 公 式：y=0.0598x+0.0159，R2=0.9992。

样液VC含量的测定：量取0.2 mL样液于10 mL具塞比色管中，向其中加入0.4 mL 10%的HCl溶液，并用蒸馏水定容至刻度后摇匀。以蒸馏水调零，在245 nm波长处测定其吸光度值，并根据标准曲线得出VC的浓度。再根据如下公式计算出样液中VC的含量。

式中：X为样液中维生素C含量，mg/kg；C为样液中抗坏血酸的浓度，μg/mL；10为样液定容体积，mL；A为样液稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.3.2 串叶松香草中总黄酮含量测定 测定串叶松香草中总黄酮的含量，依据黄酮类化合物被NaNO2还原后能与Al3+络合形成在碱性条件下显红色的络合物，于510 nm波长处检测其吸光值来计算总黄酮化合物的含量。

标准曲线的绘制：准确称取经120℃干燥至恒重的芦丁标准品0.100 g，用95%的乙醇定容至100 mL，量取15 mL于50 mL容量瓶中，用95%的乙醇定容，即得0.3 mg/mL的芦丁标准液。分别量取芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，并用95%的乙醇稀释至6 mL后，分别加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀后静置6 min；再加10%Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀后静置6 min；最后加入10 mL 4%NaOH溶液摇匀，静置12 min。以芦丁空白调零，在510 nm处测定吸光值，并以芦丁标品溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

标 准 曲 线 公 式：y=9.5167x+0.0295，R2=0.9935。

样液总黄酮含量的测定：量取4.0 mL样液于25 mL容量瓶中，余下按照标准曲线绘制中的操作，测定其吸光度值，并根据标准曲线得出总黄酮的浓度。再根据如下公式计算出样液中总黄酮的含量。

式中：X为样液中总黄酮含量，mg/kg；C为样液中芦丁的浓度，mg/mL；25为样液定容体积，mL；A为样品稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.3.3 串叶松香草中总多酚含量测定 用福林酚比色法测定串叶松香草中总多酚的含量，即根据多酚类化合物在碱性溶液中可将钨钼酸还原成蓝色化合物，于765 nm处有最大吸收的特性测定总多酚的含量。

标准曲线的绘制：制备浓度0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/L的没食子酸标准液。分别吸取1.0 mL标准液，各加5.0 mL水、1.0 mL福林酚试剂和3.0 mL碳酸钠溶液，混匀后放置2 h显色。以没食子酸空白调零，在765 nm波长处测定其吸光值并绘制标准曲线。

样液总多酚含量的测定：量取0.1 mL样液代替没食子酸标准液，余下按照标准曲线绘制中的操作，测定其吸光度，并根据标准曲线得出总多酚的浓度。总多酚标准曲线公式：y=0.1004x+0.056，R2=0.9999。再根据如下公式计算出样液中总多酚的含量。

式中：X为样液中总多酚含量，mg/kg；C为样液中没食子酸的浓度，mg/L；10为样液定容体积，mL；A为样品稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.4 抗氧化能力分析

1.2.4.1 清除羟自由基能力的测定 用水杨酸法测定串叶松香草水提液对羟自由基的清除能力，按表3所示，在具塞试管中依次加入以下各药品后摇匀，并于37℃水浴中加热15 min，于510 nm处测定其吸光值。A0测定时，以不加双氧水的体系调零；Ax、Ax0测定时，以蒸馏水调零。

根据如下公式计算样液清除羟自由基的速率：

羟自由基清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0为空白对照的吸光值；Ax为加样品的吸光值；AX0为试剂空白的吸光值。

1.2.4.2 清除1，1-二苯代苦味酞基（DPPH）能力的测定 用分光光度法测定串叶松香草水提液对DPPH的清除能力，即根据紫色的DPPH无水乙醇溶液在517 nm处有最大吸收，若向其中加入具有清除DPPH功能的样液，就可结合或代替DPPH，使自由基数量减少，吸光值变小，以此评价样液对DPPH的清除作用。

制备DPPH溶液：准确称取DPPH标准品0.005 g，溶于适量无水乙醇中，并超声5 min，使其充分溶解后，定容至100 mL。取适量DPPH溶液，在517 nm处测定其吸光度，使A=1.2～1.3为最佳。

表3 清除羟自由基试验方法mL

取DPPH溶液2 mL，向其中由少至多渐加样液，边加边混合并观察溶液的褪色情况，记下溶液颜色基本褪去时的加样量，以确定样液加入量。按表4所示，在具塞试管中依次加以下各药品后摇匀，避光静置30 min后，以无水乙醇调零，在517 nm处测定吸光值。

表4 清除DPPH试验方法mL

根据如下公式计算样液清除DPPH的速率：

式中：A0为空白对照的吸光值；Ax为加样品的吸光值；Ax0为试剂空白的吸光值。

1.2.4.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定用邻苯三酚法测定串叶松香草水提液对超氧阴离子的清除能力，即邻苯三酚在碱性条件下自氧化可产生有色中间产物使吸光值增加，此过程中吸光度值与反应时间呈线性关系。当在该反应体系中加入抗氧化物质后，抗氧化物催化超氧阴离子反应为过氧化氢，使有色中间产物生成受阻，邻苯三酚自氧化的速率降低，吸光值下降，以此作为测定该抗氧化物清除超氧阴离子的依据。

制备A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（含1 mol/L EDTANa2）；B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。按表5所示，在具塞试管中依次加入以下各药品，以A液调零，在325 nm处测其吸光值。

根据如下公式计算样液清除超氧阴离子的速率：

超氧阴离子清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0为空白对照的吸光值；Ax为加样品的吸光值；Ax0为试剂空白的吸光值。

1.3 数据分析 本试验的数据用Excel进行整理得到均值与方差，并通过SPSS（17.0）软件进行显著性分析，以最小显著差异（LSD）的t检验方法，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 串叶松香草水提液的提取条件优化

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取时间确定 由图1可知，随着提取时间的延长，不同生长期串叶松香草的SOD活性逐渐上升，在12 h时提取效果最佳，叶丛期与开花期分别为2129.48、2021.73 U/g。因此两个不同的生长期均选择12 h的提取时间进行提取。

2.1.1.2 料液比确定 由图2可知，随着料液比的减小，不同生长期串叶松香草的SOD活性逐渐上升，在料液比为1∶20时，开花期SOD活力较叶丛期高55.94%（P＜0.05）。在1∶25时两个时期的提取效果均最佳，其中叶丛期比开花期SOD活力显著升高了10.83%（P＜0.05）。因此两个不同的生长期均可选择1∶25的料液比进行提取。

表5 清除超氧阴离子试验方法mL

图1 串叶松香草各生长期不同提取时间的SOD活力

图2 串叶松香草各生长期不同料液比SOD活力

2.1.1.3 提取温度确定 由图3可知，随着提取温度的提高，不同生长期串叶松香草的SOD活性逐渐上升，在37℃时提取效果最佳，叶丛期与开花期分别为3912.49、4367.09 U/g。因此两个不同的生长期均选择37℃的提取温度进行提取。

2.2 提取条件正交试验优化 由表6、表7可知，用正交试验法确定提取条件的最佳组合，各组比较发现叶丛期与开花期均是料液比为1:25，37℃水浴中浸提12 h时SOD活性最高，分别为4030.12、4445.31 U/g。

2.3 串叶松香草类SOD活性 由表8可知，按最优提取方案对串叶松香草的类SOD其他成分进行分析得出，串叶松草开花期维生素C、总黄酮和总多酚含量极显著高于叶丛期，分别高了34.51%（P＜0.01）、56.59%（P＜0.01）和23.15%（P＜0.01）。

图3 串叶松香草各生长期不同提取温度的SOD活力

表6 叶丛期提取条件正交试验结果

表7 开花期提取条件正交试验结果

表8 串叶松香草类SOD活性成分含量比较mg/kg

2.4 串叶松香草提取液的抗氧化能力检测 由表9可知，串叶松香草开花期清除羟自由基和DPPH的能力极显著高于叶丛期，分别增加了205.65%（P＜0.01）和12.20%（P＜0.01）；开花期清除超氧阴离子的能力较叶丛期降低8.39%（P＜0.05）。

表9 不同生长期串叶松香草对自由基的清除率%

3 讨论

串叶松香草为多年生草本植物，其提取液具有抗粪肠球菌和大肠杆菌的功能（Kowalski，2007）。Shang等（2017）利用响应面法对串叶松香草活性成分提取条件进行优化，结果表明，以水料比为15 mL/g，提取时间为61 min，提取温度为97℃的工艺提取的多糖浓度最高，且冷冻干燥所保留的抗氧化活性物质浓度最高。本试验结果显示，1∶25料液比，37℃，提取12 h时得到串叶松香草水提液，叶丛期SOD活力为4030.12 U/g，开花期为4445.31 U/g。有机体生理代谢过程中细胞均会产生活性氧（ROS），在正常代谢下，细胞内ROS的产生和清除处于动态平衡，只有当ROS的产生与清除失去平衡时，才会引起氧化胁迫，多余的ROS会导致生物大分子、生物膜发生可逆或不可逆损伤，甚至引起细胞死亡。在活性氧清除反应中首先启动的抗氧化酶是SOD，通过歧化超氧阴离子自由基转化为氧分子和过氧化氢（H2O2），然后经过氧化氢酶和谷胱甘肽循环系统，将H2O2转变为水和分子氧（Yergaliyev等，2016），解除氧胁迫，保证机体健康。开花期SOD活力显著增加，表明串叶松香草在开花期的抗氧化能力强于叶丛期，且开花期类SOD活性成分VC、总黄酮和总多酚的含量分别比大叶期极显著增加了34.51%、56.59%和23.15%。本研究发现开花期比叶丛期总黄酮的含量极显著升高。黄酮类化合物可通过与金属离子螯合阻断自由基生成或与脂质过氧基（ROO·）反应，阻断脂质的过氧化过程或阻断自由基所引发的连锁反应，达到清除氧自由基和抗氧化的效果。据报道，VC清除DPPH的能力强于黄酮和芦丁，同时VC与黄酮复配抗氧化能力强于各自单独的功能（刘军军，2014）。

DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基，当羟自由基的有效浓度降低时，表明该物质能将其清除。一般情况下，植物开花期的抗氧化酶活性要高于营养生长阶段，对于多年生植物，在适应了生存环境后，在生长旺盛阶段，体内的抗氧化酶对于环境的胁迫反应更敏感，更能快速的清除多余的氧自由基。Almeselmani等（2006）证实，在高温胁迫试验中，小麦的抗氧化酶活性均为开花期明显高于营养生长阶段。本试验结果表明，开花期比叶丛期串叶松香草提取液清除羟自由基和DPPH的能力极显著增加了205.65%和12.20%。超氧阴离子是体内重要的自由基之一，同时也是所有活性氧自由基的前体，是导致自由基连锁反应的启动者，其可经过一系列反应转化生成H2O2、羟自由基（·OH）和单线态氧（1O2），作为生理环境中的毒性因子，引发一系列疾病。本试验结果表明，在开花期超氧阴离子极显著低于叶丛期。综上表明，开花期比叶丛期具有更强的抗氧化能力。

4 结论

4.1 通过单因素和正交试验，确定叶丛期与开花期串叶松香草SOD提取条件为：料液比1∶25，温度37℃，浸提时间12 h，此时提取液SOD活性分别为4030.12、4445.31 U/g。

4.2 串叶松香草水提液，开花期类SOD成分VC、总黄酮和总多酚含量较丛叶期分别极显著增加34.51%、56.59%和23.15%，同时清除羟自由基和DPPH的能力分别极显著增加205.65%和12.20%。