99mTc标记PD-L1纳米抗体用于荷非小细胞肺癌模型SPECT/CT显像

赵凌舟，邢 岩，刘长存，郭李磊，乔文礼，赵晋华

上海交通大学附属第一人民医院核医学科，上海 200080

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占其80%以上［1］。目前NSCLC的治疗手段主要包括手术、放化疗和分子靶向治疗，患者的平均生存期和5年生存率均很低［2］。近些年，通过增强机体抗肿瘤免疫力而抑制和杀伤肿瘤细胞的肿瘤免疫治疗日益受到重视，其中程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）和程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制剂是常用的肿瘤免疫治疗方法之一［3-6］。目前已批准上市的6种PD-1/PD-L1抗体药物，有4种可用于NSCLC的治疗［7-9］。PD-1/PD-L1抗体免疫治疗效果与肿瘤PD-L1高表达密切相关。穿刺活检是目前确定肿瘤组织PD-L1表达的情况主要方法，但只能代表小区域PD-L1表达状态，无法反映整个肿瘤组织和转移病灶的情况，因此需要发展能够准确检测PD-L1表达的影像学技术。本课题组前期已获得高亲和力结合PD-L1的纳米抗体，可有效识别不同PD-L1表达水平的NSCLC细胞。在此基础上，本研究进一步进行99mTc标记，开展PD-L1表达的可视化研究，通过建立不同PD-L1表达水平的NSCLC移植瘤模型，评价制备的显像剂显示肿瘤PD-L1表达的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

PD-L1纳米抗体和三羰基化合物试剂盒由苏州纳洛迈生物科技有限公司提供；Na99mTcO4购自上海原子科兴药业有限公司；HCC827和A549 NSCLC细胞、胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、HEPES缓冲液和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）及其他试剂购自上海迪奥生物科技有限公司；4～6周龄BALB/c裸小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；快速薄层色谱硅胶纸（ITLC-SG）和TLC硅胶铝板购自北京拜尔迪生物技术有限公司；放射性薄层液相色谱仪（Radio-TLC）购自美国BioScan公司；Endosafe-PTS及配套耗材购自北京恒益德科技有限公司；高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）购自日本Waters公司，配套γ检测器；小动物SPECT/CT显像于苏州大学分子影像与核医学研究中心完成，仪器购自荷兰MILabs公司；Biacore 8K高通量生物大分子分析仪购自美国GE公司。

1.2 方法

1.2.199mTc(CO)3(H2O)3的制备和质控

胰岛素注射器抽取1 mL高锝酸钠（1.8×109Bq左右），注入三羰基化合物小瓶中，瓶中粉末充分溶解后水溶（98℃），反应30 min后取出小瓶，冷却至室温，随后加入HCl溶液（1 mol/L）调节pH值至7.4左右。分别以pH=5.4的柠檬酸缓冲液为展开剂和ITLC-SG为固定相，以1%氯化氢甲醇溶液为展开剂和TLC硅胶铝板为固定相，于层析缸中展开，测量标记产物的放射化学纯度。标记率大于95%时，即制备成功，放置备用。

1.2.299mTc-PD-L1纳米抗体的制备

PD-L1纳米抗体制备过程大致步骤如下：单峰骆驼注射PD-L1抗原，免疫系统表达一系列特异性PD-L1抗体，收集血液，分离淋巴细胞，提取mRNA，然后体外转录、翻译和筛选，得到能够特异性结合PD-L1的纳米抗体。取含有200 μg PD-L1纳米抗体的PBS（100 μL），与上述制备的99mTc(CO)3(H2O)3混合于2 mL小瓶中，随后水浴（37℃），反应60 min后取出小瓶，以pH=5.4的柠檬酸缓冲液为展开剂和ITLC-SG为固定相展开，测量标记产物的放射化学纯度。

1.2.399mTc-PD-L1纳米抗体体外稳定性评价

分别取少量99mTc-PD-L1纳米抗体（200 μL）与1.8 mL PBS 和血清混合水浴（37℃）。1、2和3 h后，用HPLC计算放射化学纯度，评价体外稳定性。HPLC条件为：含1%三氟乙酸的45%乙腈水溶液为流动相，分子筛柱（300 Å，5 μm，250 mm×4.6 mm），检测波长为254 nm，流速1 mL/min。

1.2.4 体外亲和力测定

采用表面等离子体共振法测定PD-L1纳米抗体与人PD-L1蛋白的结合亲和力。所有测量均在Biacore 8K仪器上进行，使用HEPES缓冲液作为流动相。首先配置5个不同浓度（1.24×10-8、6.19×10-9、3.09×10-9、7.73×10-10和3.87×10-10mol/L）的PD-L1纳米抗体溶液，随后以30 μL/min在含有PD-L1密度高蛋白质CM5传感器芯片上展开，并记录信号强度；PD-L1纳米抗体能够与靶蛋白结合和解离，监测解离720 s，最后利用Biacore评价软件将所得的数据与理论曲线拟合，计算平衡解离常数KD值。

1.2.5 细胞培养

配制含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液。从液氮罐中取出HCC827和A549细胞冻存管，于37℃水浴箱中快速复温解冻，在超净工作台将解冻的细胞悬液吸入离心管中离心（1 000 r/min，3 min），弃上清液，加入RPMI-1640培养液重悬并移入培养皿中，于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。隔天换液，待HCC827和A549细胞生长融合成单层时，PBS浸洗3遍，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化并传代。

1.2.6 建立NSCLC裸小鼠移植模型

4～6周龄BALB/c裸小鼠随机分为2组，每组4只，分别于前肢皮下注射HCC827和A549细胞（5×106，100 μL），在标准动物饲养房中饲养，待肿瘤直径达到0.8 cm左右时用于显像。

1.2.7 细菌内毒素测定

启动Endsafe-PTS细菌内毒素快速检测仪，按照操作界面提示插入卡片和输入相关信息，然后在卡片上4个进样孔滴加25 μL标志物，进行细菌内毒素测定。

1.2.8 SPECT/CT显像

将裸小鼠麻醉后，尾静脉注射99mTc-PD-L1纳米抗体（3.7×107Bq，100 μL）后，分别于30、90 min进行小动物SPECT/CT显像。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 99mTc-PD-L1纳米抗体的制备、纯化、稳定性试验和细菌内毒素测定

本研究获得的纳米抗体，相对分子质量约为15 000，纯度大于99%，与人PD-L1蛋白具有高亲和力，KD值约为1.5×10-9mol/L（图1）。随后，利用三羰基化合物试剂盒制备标记前体三羰基锝化合物99mTc(CO)3(H2O)3，然后制备99mTc-PD-L1纳米抗体。结果显示，三羰基化合物试剂盒可成功制备99mTc(CO)3(H2O)3化合物，以pH=5.4的柠檬酸缓冲液为展开剂和ITLC-SG为固定相，99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），锝胶体位于ITLC-SG原点（Rf=0），以1%氯化氢甲醇溶液为展开剂和TLC硅胶铝板为固定相，99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG原点（Rf=0），未反应Na99mTcO4位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），计算后标记率为（97.0±2.4）%（n=3）；在制备99mTc(CO)3(H2O)3过程中，产生的锝胶体和未反应Na99mTcO4很少，无需进一步纯化；随后99mTc(CO)3(H2O)3溶液与PD-L1纳米抗体溶液混合，水浴反应60 min，以pH=5.4的柠檬酸缓冲液为展开剂和ITLC-SG为固定相，99mTc-PD-L1纳米抗体位于原点（Rf=0），99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），计算后标记率为（98.0±1.3）%（n=3）。制备的99mTc-PD-L1纳米抗体为PBS，pH在7.4左右，体外稳定性实验表明99mTc-PD-L1纳米抗体在PBS和血清中3 h内放射化学纯度均大于95%，具有良好的体外稳定性（图2）。细菌内毒素测定结果显示其含量均小于15 EU/mL，符合要求。

图 1 PD-L1纳米抗体与人PD-L1蛋白的结合亲和力测定

图 2 99mTc-PD-L1纳米抗体在PBS和血清中不同时间点的HPLC谱图

2.2 NSCLC移植瘤裸小鼠99mTc-PD-L1纳米抗体的SPECT/CT显像

NSCLC移植瘤裸小鼠的SPECT/CT图像（图3）显示：99mTc-PD-L1纳米抗体主要浓聚在肾脏和膀胱，显像剂主要通过泌尿系统排泄。整个显像期间，肝脏、脾脏、心脏、肺及软组织等显影微弱，甲状腺区未见放射性摄取。在PD-L1高表达组，注射显像剂30 min后即有显影，随后肿瘤摄取持续增加，周围组织放射性减弱，90 min时肿瘤显像清楚；而PD-L1阴性组在显像期间，肿瘤部位未见明显的放射性摄取，表明99mTc-PD-L1纳米抗体能够显示肿瘤PD-L1的表达情况，提示99mTc-PD-L1纳米抗体在体内具有良好的特异性。利用小动物SPECT/CT自带的软件进行分析，勾画出心、肺、肝、肿瘤和肌肉为感兴趣区，采用半定量的方法评价30 min时99mTC-PD-L1纳米抗体生物分布（图4），考虑到肾脏的放射性强度过高，未进行分析。结果显示，PD-L1高表达组与PD-L1阴性组在心脏、肺、肝脏和肌肉部位的放射性摄取无显著差异；而在肿瘤组织中，PD-L1高表达组显著高于PD-L1阴性组（约为后者的6倍），并且PD-L1阴性组的肿瘤摄取与肌肉接近。

图 3 皮下肿瘤裸鼠注射99mTc-PD-L1纳米抗体后（n=4）30和90 min时PD-L1高表达组和阴性组的SPECT/CT图像

图 4 99mTc-PD-L1纳米抗体在PD-L1高表达组（HCC827）和PD-L1阴性组（A549）30 min时的生物分布

3 讨 论

临床试验发现，NSCLC中PD-L1表达增加与PD-1/PD-L1抗体治疗的获益关系密切［10-12］。Rizvi等［11］以PD-L1表达率5%为阳性组临界值，将NSCLC患者分成PD-L1阳性组和PD-L1阴性组，给予PD-1抗体药物Nivolumab治疗，结果显示PD-L1阳性组的客观缓解率为50%，而PD-L1阴性组未观察到治疗反应，中位无进展生存期分别为45.6周和 36.1周，表明PD-L1表达水平与免疫治疗的有效率和预后相关。Gandhi等［12］以PD-L1表达率50%为阳性组临界值，NSCLC患者经过PD-1抗体药物Pembrolizumab治疗6个月后，PD-L1阳性组和PD-L1阴性组的客观缓解率分别为67%和0%，中位无进展生存期率为67%和11%，总生存率为89%和33%，提示PD-L1表达状态可作为一个免疫治疗的疗效预测指标用于筛选免疫治疗优势人群。国内临床研究也报道了类似的结论，Chen等［13］的研究提示NSCLC患者的原位肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞的PD-L1表达率均与淋巴结转移呈负相关。马薇等［14］发现NSCLC患者的肿瘤细胞及肿瘤间质淋巴细胞和巨噬细胞的PD-L1表达水平与临床分期、淋巴结转移和预后生存密切相关。因此，随着PD-1/PD-L1抗体治疗NSCLC的快速发展，有关PD-L1表达在NSCLC中筛选免疫治疗优势人群、指导诊断及评价疗效的临床需求也日益增加。

穿刺活检是当前临床上检测PD-L1表达的主要方法，但将此方法得到的PD-L1表达水平结果作为PD-1/PD-L1抗体治疗的启用标准仍存在一些难题：① 不同PD-1/PD-L1抗体治疗采用的检测方法不同，可能会产生不一致的结果；② 不同的临床试验使用不同的PD-L1阳性阈值（范围：1%～50%），可能会导致评估缓解或生存情况的结论存在差异。此外，该方法还存在多种技术性问题：① 肿瘤组织穿刺活检有损伤性，不宜多次进行；② 一般只针对原位肿瘤组织，难以对转移病灶取样；③ 肿瘤组织中PD-L1的表达具有异质性，不同部位PD-L1的表达存在差异，且PD-L1表达会随时间和治疗情况发生动态变化，而活检组织染色只能代表小区域PD-L1的表达状态，无法完整、准确地反映整个肿瘤组织和转移病灶的情况，可能造成假阴性。这或许可解释为什么一些PD-L1表达量较高的NSCLC患者临床治疗反应不显著，而PD-L1低表达甚至阴性的患者却能获得良好的PD-1/PD-L1治疗反应。因此，临床需要一种新方法，准确、全面、安全地反映肿瘤PD-L1的表达和分布情况，以弥补当前穿刺活检技术的缺陷。

核医学影像技术以灵敏度高、无创、全面等特点，成为当前应用于肿瘤等重大疑难疾病诊断、分期、疗效及预后评估的最先进手段。因此，采用核医学影像技术实现PD-L1表达的可视化，具有众多优势：① 一次显像可检测原位肿瘤组织及转移病灶；② 能够多次检查，筛选免疫治疗优势人群及跟踪治疗效果；③ 无创检查，避免取样误差。目前国内外已有多个研究小组利用放射性核素标记PD-1/PD-L1抗体，进行肿瘤组织PD-L1表达的可视化研究［15-23］。然而，这些抗体作为分子探针存在很多问题：① 体内半衰期过长，血液清除缓慢，一般至少需要24 h才能有效成像；② 非靶向器官的摄取高，靶本比低；③分子结构复杂，稳定性差且易降解，难以大规模生产；④ 核素标记工艺复杂，难以应用于临床。

本研究采用的纳米抗体是一种天然的、只有重链可变区的独特抗体，相对分子质量只有传统抗体的1/10，约为15 000，与人源PD-L1具有高亲和力，KD值为1.5 ×10-9mol/L。除此之外，该纳米抗体还具有以下优点：① 设计的纳米抗体与PD-L1抗体药物结合肿瘤PD-L1的位点不同，避免影响免疫治疗；② 相比于PD-L1抗体，本研究的纳米抗体在血液中循环时间短，较快进入肿瘤组织；③ 非靶向器官摄取少、代谢快，如肺、肝脏和肌肉，短时间内可通过肾脏排出体外，靶本比高；④ 只保留具有识别结合活性的重链可变区，相对分子质量小，更容易渗透到肿瘤组织，可减少抗体用量，提高显像效果；⑤ 分子结构相对简单、稳定性高。

在99mTc标记方面，本研究使用三羰基化合物试剂盒制备标记前体三羰基锝化合物，成功标记了纳米抗体。该方法：① 标记步骤简便、重复性好；② 标记率和放射化学纯度高，大于95%，无需进一步纯化，可直接使用；③ 体外稳定性良好，HPLC结果显示3 h内放射化学纯度无明显变化。

本研究的纳米抗体相对分子质量仅为15 000，远小于PD-L1抗体及其抗体片段，有助于短时间内渗透到肿瘤组织，不仅能在1～2 h内获得有效显像，还可以选择目前临床上最理想SPECT核素99mTc，以获取更佳的显像效果。同时，纳米抗体与PD-L1蛋白具有高亲和力，体外测定KD值为1.5×10-9mol/L，对体内肿瘤显像非常有利。PD-L1高表达组在30 min时，肿瘤有明显摄取，90 min时仍有高摄取；而显像期间，PD-L1阴性组肿瘤组织无明显放射性聚集。此外，纳米抗体相对分子质量较小且亲和力高，有助于获得良好的药代动力学性质。正如体内显像和生物分布结果所示，99mTc-PD-L1纳米抗体在肺、肝和肌肉等非靶器官低摄取，并且经泌尿系统快速排出体外，不仅能获得高靶本比，还可减少机体受到的辐射剂量。考虑到PD-1/PD-L1抗体药物的治疗机制是阻断免疫细胞PD-1与肿瘤细胞上PD-L1结合，若选用与抗体药物结合位点相同的显像剂，PD-1/PD-L1抗体药物治疗会干扰该类显像剂对PD-L1表达情况的诊断，因此本研究在设计该纳米抗体时，选择与PD-L1抗体药物相同的靶向分子（即肿瘤细胞表面的PD-L1），但靶点位置不同，避免两者相互影响，以期获得更加准确的结果。

上述研究结果提示，99mTc-PD-L1纳米抗体有潜力成为一种方便、快捷及有效的显像剂，有望成为显示PD-L1表达、分布以及转移病灶的影像学技术。99mTc-PD-L1纳米抗体有助于筛选优势人群，提高免疫治疗效益，监测治疗效果，避免不必要的治疗，尤其是对于组织穿刺活检显示为PD-L1阴性者，能够提供更全面和准确的信息。