食品中降尿酸活性物质及其作用机理研究进展

邹 琳,冯凤琴

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,农业部农产品采后处理重点实验室, 浙江省农产品加工技术研究重点实验室,浙江杭州 310058)

近年来,随着生活方式、饮食习惯和周围环境等因素的改变,痛风发病率呈逐年上升趋势。痛风是人体嘌呤代谢异常所致的一组代谢性疾病,其生化基础是高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)。临床上,当男性血尿酸水平大于7.0 mg/dL,女性血尿酸水平大于6.0 mg/dL即可确诊为高尿酸血症[1]。长期的高尿酸水平对血管、心脏、肾脏均会产生一系列不良后果,增加了患心脑血管疾病、高血压、糖尿病及肾脏疾病等的风险[2-4]。目前,临床用降尿酸药物可以归为三种类型:第一类是抑制尿酸生成类药物,包括别嘌呤醇(Allopurinol)、非布索坦(Febuxostat)等;第二类是促进尿酸排泄类药物,包括丙磺舒、苯溴马隆、RDEA594等;第三类是促进尿酸分解类药物,如培戈洛酶Pegloticase。这些西药虽然药效明显,但容易引起严重过敏反应、胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害等毒副作用[5-7]。因此,开发食品来源的、新型的、低毒副作用的降尿酸活性物质具有重要的意义。已有大量研究证明,黄酮类、酚酸类、生物碱类等活性物质均具有降尿酸作用[8],而对于生物活性肽和益生菌的降尿酸作用的研究尚处于起步阶段[9-10]。本文主要围绕高尿酸血症的发病机制,对黄酮类、酚酸类、生物碱类、生物活性肽和益生菌等五类食品中降尿酸活性物质及其降尿酸机理的研究进展进行综述,以期为开发降尿酸功能食品提供研究思路。

1 高尿酸血症的发病机制

高尿酸血症的发生主要与尿酸过度产生和尿酸排泄不足有关。体内尿酸的生成主要由嘌呤类代谢相关酶控制,而尿酸的排泄主要由尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白调控(见图1)。

图1 体内尿酸生成和排泄途径Fig.1 Uric acid production and excretion pathway in vivo

1.1 嘌呤类代谢相关酶调控尿酸生成

人体内的尿酸来源主要分为内源性和外源性两方面,其中67%的尿酸是由体内核蛋白、核酸等物质分解代谢产生,而剩下的33%来源于食物中的嘌呤类物质[11]。在嘌呤类物质代谢成尿酸的过程中,腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase,ADA)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XO)是调控尿酸生成的关键酶[12]。ADA属于巯基酶,能催化腺嘌呤核苷生成次黄嘌呤核苷,再经过核苷磷酸化酶作用生成次黄嘌呤,最终被XO氧化生成尿酸[13]。XO是一种黄素蛋白酶,分子量为290 kDa,催化中心由两个铁-硫中心[2Fe-2S]、一个钼蝶呤中心(Mo-pt)及一个黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)组成[14],其作用是将次黄嘌呤转化成黄嘌呤,将黄嘌呤转化成尿酸[15]。

1.2 尿酸重吸收蛋白和分泌蛋白调控尿酸排泄

人体内生成的尿酸约70%由肾脏排出,30%由肠道排出[16]。目前已发现多种转运蛋白参与肾脏近曲小管尿酸的转运过程,分为重吸收蛋白和分泌蛋白两大类[17],分布在肾脏近曲小管顶端膜和基底外侧膜。尿酸重吸收蛋白包括尿酸盐阴离子转运体1(Urate transporter 1,URAT1),葡萄糖转运蛋白9(Glucose transporter 9,GLUT9),有机阴离子转运体(Organic anion transporters,OATs)家族中的OAT4和OAT10及钠偶联单羧酸转运体(Sodium-coupled monocarboxylate transporter,SMCT)[18-19],这些蛋白与尿酸自肾小管腔向上皮细胞内的重吸收有关。尿酸分泌蛋白包括OAT1、OAT2和OAT3,多药耐药蛋白4(Multidrug resistance associated protein 4,MRP4),钠依赖性磷酸转运蛋白(Sodium-dependent phosphate transporter proteins,NPTs)家族中的NPT1和NPT4,三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette,subfamily G,membrane 2,ABCG2)[20],与尿酸向小管腔分泌有关。若机体尿酸重吸收蛋白或分泌蛋白表达异常,造成尿酸重吸收增加或排泄减少,就会导致高尿酸血症。

2 黄酮类降尿酸活性物质

黄酮类化合物是一大类多酚天然产物,广泛分布于各种植物中。诸多黄酮类化合物具有多种生物学和药理学活性[21],如木犀草素、芹菜素、槲皮素和落新妇苷等具有较强的降尿酸活性。木犀草素(Luteolin)是世界上广泛用作食品的芹菜和青椒的主要组分之一,研究表明,木犀草素能在单个结合位点以疏水性相互作用与XO结合,竞争性地抑制黄嘌呤氧化酶的活性,其抑制常数(Ki)值为(2.38±0.05)×10-6mol/L[22]。芹菜素(Apigenin)是天然存在的一种黄酮类化合物,广泛分布于温热带的蔬菜和水果中。Miao等[23]发现芹菜素可以通过下调氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠肾脏中URAT1蛋白的表达,达到降低尿酸的目的。槲皮素(Quercetin)的化学结构中含有3,5,7-三羟基团,Nile等[24]从洋葱废渣中提取并分离得到槲皮素及槲皮素的多种苷类化合物,并研究发现槲皮素及槲皮素-3,4′-O-二糖苷的抗氧化活性及黄嘌呤氧化酶抑制活性最强,其XO抑制活性IC50分别为(10.5±0.06)、(15.3±0.02) μg/mL,阳性对照别嘌呤醇的IC50为(6.5±0.05) μg/mL,说明从植物提取物中获得的黄酮类物质具有潜在的治疗高尿酸血症的应用前景。林恋竹等[25]对比了神秘果树叶的乙醇、水提取物在氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠体内的降尿酸作用,并采用现代色谱、波谱技术导向分离鉴定出3种槲皮素类化合物,为神秘果树叶乙醇提取物用作保健食品功效因子提供了一定的理论依据。Adachi等[26-27]在探究别嘌呤醇、槲皮素及黄杉素(Taxifolin)的体外降尿酸作用时,以鸟苷和肌苷为前体物质建立了鼠源AML12肝细胞模型,通过测定平衡盐溶液中尿酸含量的变化来反应三种物质对肝细胞吸收利用尿酸前体物质的抑制作用,并利用次黄嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸诱导的高尿酸血症小鼠模型分析验证了降尿酸机理。XO在催化黄嘌呤、次黄嘌呤生成尿酸时,会产生超氧阴离子自由基、过氧化氢等,对机体造成损伤。而研究表明,落新妇苷(Astilbin)可以调节氧化应激和炎症反应,从而降低尿酸和改善肾损伤[28]。诸多研究表明黄酮类化合物可以抑制黄嘌呤氧化酶的活性,特别是具有7-羟基的平面黄酮和黄酮醇[29-30]。Lin等[31]利用紫外光谱法和荧光滴定法研究了20种类黄酮的结构与XO抑制活性及亲和力的关系,结果表明,疏水性相互作用在类黄酮与XO的结合中发挥重要作用,并且XO抑制活性通常随着黄酮类和黄酮醇类与XO的亲和力的增加而增加。

黄酮类物质由于其平面结构,羟基、双键等位置的不同在XO抑制活性方面有所不同。木犀草素、芹菜素、槲皮素等黄酮或黄酮醇类物质较异黄酮、二氢黄酮等XO抑制活性更强,主要由于其平面结构较其他黄酮类物质更紧密,分子间引力也更强。

3 酚酸类降尿酸活性物质

酚酸类化合物系指在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物,具有增强免疫、抗氧化、抗菌消炎、降血脂等多种生理活性,在食品、医药领域有着广泛的应用前景[32]。Honda等[33]研究表明富含酚酸类物质的菊花油能够降低血清尿酸水平,其作用机理在于通过抑制肝脏中XO的活性来抑制尿酸的产生,并通过调节肾脏中尿酸转运蛋白基因表达加速尿酸排泄。Chen等[34]以不同剂量的绿茶多酚提取物灌胃处理氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠,发现总酚含量为81.41%的绿茶多酚提取物能够显著降低小鼠血尿酸水平(p<0.05),同时不同剂量均能极显著抑制血清和肝脏中XO活性(p<0.01),下调肝脏中XO蛋白及肾脏中URAT1蛋白的表达水平(p<0.05),上调肾脏中OAT1及OAT3蛋白的表达水平(p<0.05)。白藜芦醇是一种主要存在于虎杖、葡萄等植物中的多酚类化合物,Lee等[35]通过氧嗪酸钾和尿酸混合物诱导的高尿酸血症大鼠模型证明,白藜芦醇能够极显著降低血清尿酸水平(p<0.001),且尿酸水平与肾脏中URAT1 mRNA的表达呈负相关,即白藜芦醇能够抑制肾脏中URAT1 mRNA的表达,从而减少尿酸在肾小管中的重吸收。Jiang等[36]以匙叶鼠曲草(Gnaphaliumpensylvanicumwilld.)提取物分别处理氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠和单钠尿酸盐(MSU)诱导的急性痛风性关节炎(Gouty arthritis)小鼠,结果发现所有剂量的匙叶鼠曲草提取物均能极显著降低尿酸含量(p<0.01)、抑制肝脏XO活性(p<0.01)、下调URAT1和GLUT9蛋白的表达水平(p<0.01),同时减少炎性细胞浸润,改善MSU诱导的炎症,同时通过UHPLC-ESI-MS/MS分析得知该提取物中主要的活性成分是13种咖啡酰奎宁酸衍生物。Ferraz-Filha等[37]通过高尿酸血症和急性痛风性关节炎动物模型,证明咖啡酸和绿原酸均具有降尿酸和缓解炎症的作用,其体外降尿酸IC50值分别为42.60、56.21 μmol/L。同时,与别嘌呤醇相比,绿原酸还能显著降低高尿酸血症大鼠血清肌酐和尿素氮的含量(p<0.05),对肾脏有较好的保护作用[38]。此外,迷迭香酸、菊苣酸等也都具有一定的XO抑制活性[39-40]。

酚酸类物质主要是通过抑制体内XO活性来减少尿酸的生成从而达到降尿酸的效果,少数是通过促进尿酸转运和排泄从而减少尿酸的重吸收。因此,研究其他具有降尿酸活性的酚酸类物质可以聚焦于抑制XO活性。

4 生物碱类降尿酸活性物质

生物碱类是广泛分布在自然界中化学结构相对较为复杂的天然产物活性成分之一,呈碱性,具有抗肿瘤、抗菌、降血压等多种药理活性。Sang等[41]探究了荷叶水提物中降尿酸的有效成分,通过UHPLC-Q-TOF/MS及分子对接证明莲碱(Roemerine)与XO结合的关键在于氢键及疏水性相互作用,与非布索坦相比,莲碱的结构可以完全满足活性结合位点的要求,除了苯丙氨酸(L-Phenylalanine,Phe)914和1009以外,所有关键结合氨基酸残基如亮氨酸(L-Leucine,Leu)648、873、1014,Phe 649和缬氨酸(L-Valine,Val)1011均与莲碱有一定的相互作用。研究表明,甜菜碱通过调节高尿酸血症小鼠肾脏有机离子转运蛋白的表达水平而具有抗高尿酸血症和肾脏保护作用[42]。同时,甜菜碱能显著下调高尿酸血症小鼠肾脏URAT1和GLUT9蛋白的表达水平,抑制尿酸的重吸收;通过上调mOAT1和ABCG2蛋白的表达水平,促进尿酸排泄。此外,甜菜碱还可上调HUA小鼠肾脏有机阳离子转运体(Organic cation transporters,OCTs)家族的OCT1/2和有机阳离子/肉毒碱转运体(Organic cation/carnitine transporters,OCTNs)家族的OCTN1/2的蛋白表达水平,对肾脏起到保护作用[43]。中药青风藤具有祛风除湿、通络止痛的作用,其主要成分青藤碱(Sinomenine)能有效降低痛风性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL-1β)及环氧化酶-2(COX-2)的水平,减少前列腺素类的合成,抑制炎症进一步扩大,缓解关节疼痛[44]。

生物碱类由于其复杂的结构和较强的生物活性,其在降尿酸方面的功效也不容忽视。它不仅可以通过抗炎症来缓解痛风的症状,而且可以从促进尿酸排泄和抑制尿酸重吸收等方面发挥降尿酸的功能。

5 生物活性肽

生物活性肽是指通过发酵、酶解、化学水解等方式获得的具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、镇痛、抗炎症等特殊生理作用的多肽,其肽链长短不一,结构各不相同[45]。近年来,随着对生物活性肽研究的深入,具有XO抑制活性的食源性生物活性肽备受关注。

5.1 内源性生物活性肽

目前关于具有降尿酸活性的内源性生物活性肽的研究比较少,主要集中在肌肽及其类似物。肌肽是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽,最早是在1900年被发现。肌肽及其类似物,如鹅肌肽、鲸肌肽等以游离的形式主要分布于哺乳动物和其他脊椎动物的骨骼肌中,具有抗氧化、抗衰老、抗聚糖、神经调节等作用[46]。Kubomura等[47]在男性受试者中进行了随机的双盲实验,结果发现高剂量的含有咪唑化合物的金枪鱼提取物与安慰剂相比显著降低了血尿酸水平,并提出三个作用机制,一是金枪鱼提取物中的咪唑化合物能够促进次黄嘌呤磷酸核糖转移酶表达,降低次黄嘌呤和鸟嘌呤含量;二是促进乳酸脱氢酶的表达,催化丙酮酸和乳酸盐的相互转化,激活URAT1,促进尿酸的再吸收和尿排泄;三是肌肽被血液吸收,通过肌肽酶水解成π-甲基组氨酸和β-丙氨酸,通过质子缓冲能力,稳定尿液的pH,提高尿酸的溶解度并加速尿酸排泄。Otsuka等[48]首次利用HEK293-URAT1细胞探究了β-丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、肌肽和鹅肌肽硝酸盐的降尿酸机理,结果表明,肌肽、鹅肌肽硝酸盐及3-甲基组氨酸均能够抑制URAT1及XO活性,由此可以得出咪唑环本身或甲基的位置对其降尿酸活性有一定的影响,同时得到市售鹅肌肽硝酸盐的降尿酸IC50为(6.45±1.57) mmol/L。

5.2 外源性生物活性肽

外源性生物活性肽主要是通过可控酶解法对蛋白质进行水解,以获得具有不同生物活性的肽类产物。Nongonierma等[49-50]利用胰酶和胃蛋白酶酶解牛乳蛋白制备二肽,在制备得到的12种二肽中,只有含有色氨酸(L-Tryptophan,Trp)的二肽表现出XO抑制活性,通过分子对接技术发现Trp与XO的第二结合位点结合,属于非竞争性抑制。刘丹等[51]利用LO2细胞构建体外高尿酸血症细胞模型,在尿酸生成途径中的中间产物腺苷的诱导下,添加一定浓度的黄嘌呤氧化酶孵育,模型组尿酸生成量显著增加,当添加一定浓度的乳清蛋白肽时,尿酸生成量相对于模型组显著降低,这表明乳清蛋白肽具有降尿酸的效果。Murato等[52]发现鲨鱼软骨的Alcalase水解物中含有降尿酸活性的多肽,静脉注射Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr和Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr小分子肽能够降低血清尿酸水平,但是其在体外时并没有XO抑制活性。而一些来源于这些小分子肽的二肽或三肽如Asp-Asn却表现体外XO抑制活性,这可能是Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr等在消化吸收的过程中分解成更小的肽段，从而发挥XO抑制活性或诱导了内源性XO抑制剂的活性。Li等[53]发现核桃粉水解物和脱酚核桃粉水解物在体外和体内实验中均表现出降尿酸活性,通过葡聚糖凝胶柱及RP-HPLC分离和LC-ESI-MS/MS分析鉴定,得到两种降尿酸肽WPPKN和ADIYTE,并利用分子模拟得到,WPPKN能进入疏水通道,从而阻断黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶之间的相互作用,而ADIYTE位于B链表面,能阻止底物进入疏水基团渠道。赵谋明等[54]以中性蛋白酶和胰酶水解秋刀鱼制备XO抑制肽,采用响应面分析法研究了加酶量、酶解时间和中性蛋白酶所占比例对酶解氮回收率及XO抑制活性的影响,并通过肽分子量分布得到该秋刀鱼酶解产物以小于3 kDa的肽段为主,说明小分子肽更易具有降尿酸活性。Li等[55]通过高尿酸血症大鼠模型评价比较了狐鲣酶解物、脱酚核桃酶解物和大豆蛋白酶解物的体内降尿酸作用,发现狐鲣酶解物能够显著抑制XOD活性,同时能够减缓肾脏损伤,经过分离纯化鉴定后获得体外具有XOD抑制活性的六肽和三肽。

生物活性肽由于其来源广泛且较其他生物活性物质更易获得,在降尿酸方面具有得天独厚的优势。活性结构方面,发挥降尿酸活性的成分主要是小分子肽类物质;作用机制方面,生物活性肽类物质并不是通过直接抑制XO活性来发挥作用,而可能是其体内代谢物具有XO抑制活性或者通过其他途径来达到降尿酸的效果。因此,生物活性肽类物质的降尿酸机理还需从代谢转运及其作用通路开展更深入的研究。

6 益生菌

人体经过进化,体内缺乏有生物活性的尿酸氧化酶,因而尿酸就是嘌呤类物质代谢的最终产物。益生菌作为肠道重要的生理菌群,具有增强免疫系统等多种益生功效,同时含有尿酸氧化酶,可以将尿酸代谢成为水溶性好、对人体无毒的尿囊素。金方等[56]从多株实验菌株中筛选获得了具有降解核苷酸、核苷、嘌呤及尿酸能力最强的益生菌,最后筛选得到了具有较强降解核苷酸与核苷能力的LactobacilluscaseiZM15,并通过高尿酸血症大鼠模型验证其降尿酸作用。Li等[57]从酸白菜中筛选得到三株具有快速降解肌苷和鸟苷能力的乳酸菌,并通过比较这三株菌的耐酸性、胆汁耐受性、抗病菌、细胞粘附力、抗生素抗性和过氧化氢产生能力等进一步筛选得到LactobacillusplantarumWCFS1的相似株DM9218。Yamada等[58]通过同位素标记、体外HPLC测定发现LactobacillusgasseriPA-3(PA-3)表现出较强的14C-腺嘌呤、14C-腺苷和14C-AMP吸收能力,并通过动物模型进一步发现PA-3能够吸收14C-IMP、14C-肌苷和14C-次黄嘌呤,继而减少尿酸的合成[59]。基于对PA-3的研究,日本明治株式会社的PA-3益生菌产品目前已在日本上市。此外,通过一定手段改良的益生菌也可以具有它们最初未有的能力。Bai等[60]通过尿毒症血清诱导并利用物理和化学方法改良Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus,发现该菌被诱导出降解尿酸以及其他尿毒症毒素的能力。

以上研究均认为,益生菌能降解尿酸的前体物质从而降低尿酸水平。由于肠道菌群本身是一个复杂的微生态体系,因此相关作用机制也较为复杂,有待新一轮的证据来证明益生菌降尿酸的作用机制。

7 结论与展望

近年来高尿酸血症及痛风的患病率急剧升高,但临床治疗使用的药物品种有限,并且具有明显的毒副作用,因此迫切需要开发高效低毒的降尿酸活性物质。本文综述了黄酮类、酚酸类、生物碱类、生物活性肽和益生菌等五类食品中降尿酸活性物质及其降尿酸机理的研究进展,其中黄酮类、酚酸类、生物碱类等活性物质防治高尿酸血症效果确切,主要是通过影响嘌呤代谢中的关键酶及调控尿酸盐转运蛋白的表达,进而发挥降尿酸功效,具有多环节、多层次、多靶点的调控机制。但在体外XO活性抑制实验、细胞实验和高尿酸血症动物模型实验体系中,同一活性物质对相同生化指标的影响有时并不一致,有待进一步建立规范标准的评价体系;且体内实验的测定指标多侧重于血清和肝脏中XO活性以及肾脏中肌酐、尿素氮等的含量,缺乏更为深入的基因组学和蛋白组学的分析,同时这些活性物质的提取成本极高,极大地限制了他们的实际应用。相比之下,蛋白来源的小分子降尿酸生物活性肽具有制备成本低、安全性高、易吸收等特点,逐渐成为降尿酸领域的研究热点,但目前的研究存在研究对象狭窄、构效关系不明确、作用机理不清晰等问题,有待进一步深入研究。作为肠道重要的生理菌群,益生菌的降尿酸作用研究尚在起步阶段,其降尿酸作用机理缺乏更为全面系统的深入研究。此外,对食品中降尿酸活性物质的作用机理研究多停留在动物水平,缺乏大规模的临床试验证据。

从多角度发掘食品中黄酮类、酚酸类、生物碱类、生物活性肽和益生菌等降尿酸活性物质,明确其降尿酸作用机理,真正实现在防治高尿酸血症及痛风的临床应用,已成为该领域亟待解决的问题。