曹 塬,刘 杰
(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)
痛风性关节炎是由于嘌呤代谢紊乱、尿酸产生过多或排泄障碍,造成血尿酸浓度增高,尿酸钠结晶沉积于关节导致的一种以关节疼痛、肿胀、畸形为主的疾病[1]。在急性发作期,病变关节滑膜炎性细胞浸润、表面充血水肿、组织局部坏死,并伴随关节积液及周围组织中炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1α(IL-1α)含量均显著增多[2-4]。病发时主要表现为关节红、肿、热、痛,常因饮酒、高嘌呤饮食等诱发,是成年人常见的炎性关节疾病之一[5-6]。目前西药对于痛风性关节炎的治疗主要是控制发作症状,但复发率高,很难阻滞疾病进程或根治,且西药大多不良反应大,危害患者健康[7]。有研究报道中医药治疗痛风具有很好的疗效,且不会产生严重副反应[8-9]。
土三七常种植于我国云南、广东、四川、浙江、江苏等省,因其药食同源的特点而被大众所知[10]。其具有补血活血、消肿散瘀的功效,有研究表明土三七有抗菌消炎、抗HIV活性[11]。基于土三七的抗炎作用,对于其改善痛风性关节炎作用尚未出现有关报道,故本研究对土三七提取物(Garcinia Extract,GE)治疗尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎进行了初步探索,以期为进一步研究土三七用于防治痛风性关节炎奠定理论基础。
GE(土三七提取物) 喜乐福酒业有限公司;试验动物 180~220 g Sprague Dawley(SD)大鼠,合格证编号:SCXK(湘)2016-0002,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司;辐照鼠料 北京科澳协力饲料有限公司;尿酸钠晶体 Sigma公司;氯化钠 国药集团化学试剂有限公司;ELISA试剂盒 杭州联科生物技术股份有限公司;羧甲基纤维素钠 国药集团化学试剂有限公司。
IVC独立通气笼设备 苏州冯氏实验动物设备有限公司;WH-985-C7恒温振荡培养箱 泰宏医疗器械有限公司;H1850台式高速冷冻离心机 离心机仪器有限公司;PL-DNM-9602酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司。
1.2.1 实验动物分组与造模 50只SD大鼠适应性喂养一周后,按体重随机平均分为5组,每组10只。分组情况:正常组、急性痛风性关节炎模型组、GE高剂量组(300 mg/kg)、GE中剂量组(200 mg/kg)、GE低剂量组(100 mg/kg)。首先将样品GE溶于生理盐水中,加入适量的羧甲基纤维素钠配制成对应浓度的混悬液。实验前6 d,药物组按1.0 mL/kg灌胃,其他组给予等量生理盐水,每天一次。末次给药1 h 后,将大鼠麻醉后仰卧固定,将左踝关节弯曲,用注射器自两骨突之间进针,注入3%无菌尿酸钠溶液100 μL,以关节囊对侧鼓起为注入标准,制备急性痛风性关节炎模型[12-13]。正常组大鼠关节注射等体积的无菌生理盐水。
1.2.2 大鼠步态评分及关节周径测量 分别于造模后6、8、12、24、48 h对各组大鼠步态进行评分。评分标准[14]为:0分为正常步态,双足均匀着地;1分为轻度跛行,受试下肢略有弯曲;2分为中度跛行,受试下肢刚触及地面;3分为重度跛行,受试下肢离开地面,三足着地行走。
于造模前及造模后 6、8、12、24、48 h后分别在受试踝关节相同部位,用无弹性软尺测量每组大鼠的踝关节周长,记录数据。并观察造模前后受试大鼠关节周长的变化。通过测量不同致炎时间各组大鼠踝关节周径,计算对相应时刻大鼠关节肿胀度及药物抑制率,计算公式如下[15]:
某时刻肿胀率(%)=致炎t时间踝关节周径-致炎前踝关节周径/致炎前踝关节周径×100
式(1)
某时刻抑制率(%)=模型组t时肿胀率-给药组t时仲胀率/模型组t时肿胀率×100
式(2)
1.2.3 关节组织病理学检测 造模48 h后,处死大鼠取其病损关节,加4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水、透明、包埋、切片,进行HE染色,于显微镜下观察关节滑膜组织病理形态学改变。
1.2.4 炎症因子含量测定 于造模48 h处死大鼠,腹主动脉取血,静置30 min后,3000 r/min离心20 min,取上清液分装与EP管中,置于-80 ℃冻存。采用双抗体夹心ELISA法检测IL-1β、IL-1α、TNF-α含量,根据试剂盒使用说明进行实验操作。
于造模0、6、8、12、24、48 h分别对各组大鼠进行步态分析及评分,正常组大鼠步态正常,活动自如;模型组大鼠活动明显减少,行走时出现明显跛行,食量减小,饮水次数减少,步态评分较正常组显著升高(p<0.05),提示造模成功,模型组大鼠在造模8~12 h期间步态评分达到最高;与模型组相比,GE低、中、高剂量组大鼠步态有明显改善,其中GE低剂量组在造模8、12 h步态评分显著降低(p<0.05),GE中、高剂量组在造模后直至24 h内步态评分较模型组均显著降低(p<0.05),48 h后GE高剂量组大鼠步态基本恢复正常,显示药物组对大鼠急性痛风性关节炎有缓解作用,并且呈现一定的剂量依赖性,结果见表1。
各组大鼠均于造模后0、6、8、12、24、48 h进行踝关节周径测定,并计算关节肿胀度,结果如表1所示。由表1可见,与造模前相比,模型组大鼠踝关节周径均大于正常组(p<0.05),提示造模成功。模型组大鼠关节肿胀度在造模6 h后明显升高,并于造模12 h后达到最大值(34.7%);与模型组相比,GE中、高剂量组大鼠关节肿胀度均低于模型组大鼠,并且GE高剂量组效果优于GE低剂量组(p<0.05);GE低剂量组与模型组大鼠关节肿胀度无明显差异。GE中、高剂量组在改善大鼠急性痛风方面均表现良好,随着时间推移,GE高剂量干预疗效优于GE中剂量。
表1 GE对大鼠步态评分及关节肿胀度(%)的影响Table 1 Effect of GE on gait score and joint swelling(%)in
根据每造模后各时间段肿胀度的计算,代入公式(2)中计算出药物抑制率(表2所示)。
表2 GE对大鼠关节肿胀抑制率(%)的影响Table 2 Effect of GE on inhibition rate(%)of
通过与模型组大鼠关节肿胀度相比,GE中、高剂量抑制关节肿胀效果显著(p<0.05),其中GE高剂量抑制大鼠关节肿胀效果极显著(p<0.01),GE中剂量组抑制率在致炎后6 h达到47.1%,随着时间推移,GE中剂量组抑制率在8~48 h内保持在20%以上,GE高剂量组抑制率在大鼠致炎后6~48 h内均保持在50%以上,与GE低剂量组相比,呈现一定的剂量依赖性。
对大鼠滑膜组织染色结果(图1)显示,正常组大鼠关节滑膜及周围组织正常,无炎性细胞浸润;模型组大鼠关节滑膜表面粗糙不平,可见大量的炎性细胞浸润,滑膜组织周围有密集的炎症细胞分布;给予GE的药物组大鼠关节滑膜中炎性细胞明显减少,且中、高剂量干预效果明显,关节周围软组织充血水肿明显减轻,炎性细胞浸润明显减少。
图1 GE对尿酸钠诱导的大鼠痛风性关节炎滑膜组织炎症细胞浸润的影响(HE,200×)Fig.1 Effect of GE on inflammatory cell infiltration in synovial tissue of rat gouty arthritis induced by sodium urate(HE,200×)
GE对尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎48 h后关节组织中炎症因子IL-1α、TNF-α、IL-1β水平的影响见图2。炎症因子检测结果显示,在尿酸钠造模成功48 h后,与模型组大鼠相比,GE中、高剂量组大鼠关节滑膜组织中IL-1α、TNF-α、IL-1β含量明显降低,与模型组相比有显著差异(p<0.05)。
图2 GE对尿酸钠诱导的大鼠 痛风性关节炎部分炎症因子的影响Fig.2 Effect of GE on some inflammatory factors in rat gouty arthritis induced by sodium urate注:与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01。
机体长期嘌呤代谢异常,引起血尿酸含量升高或体外排出尿酸量减少,从而导致尿酸盐在体内沉积[16-17]。尿酸盐能够诱发体内炎症因子的产生及释放,造成炎性细胞浸润现象,因此机体内尿酸盐沉积是建立急性痛风性关节炎模型的靶点[18-19]。炎症因子IL-1α、IL-1β、TNF-α是炎症反应的直接诱导因素,其中IL-1β起着关键作用,它通过抑制关节滑膜组织中酶的表达引起关节软骨胶原蛋白的变性或损失,引起局部关节红肿、关节表面温度升高、病变关节表面发热、关节疼痛等症状[20-23]。根据尿酸钠注射引起的大鼠急性痛风性关节炎模型,能够很好地模拟人体痛风性关节炎症状,据此考察GE对尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎的缓解作用。
研究结果表明,GE中、高剂量对大鼠踝关节肿胀程度有显著缓解作用(p<0.05)。造模成功后,模型组大鼠注射尿酸钠部位关节产生明显肿胀,与正常组大鼠相比有显著差异(p<0.05),在造模12 h后模型组大鼠关节肿胀度达到最高峰34.7%,而GE中、高剂量组大鼠踝关节肿胀度明显降低,统计学结果显示其与模型组大鼠相比有显著差异(p<0.05)。GE中、高剂量对痛风性关节炎大鼠的关节肿胀有较明显的改善作用,证明GE对急性通风性关节炎有积极作用,其中GE中剂量组大鼠在造模12 h后的关节肿胀度降到25%,GE高剂量组大鼠关节肿胀度则降至20%以下。步态分析及病理实验结果显示GE中、高剂量对大鼠急性痛风性关节炎的改善作用均显著(p<0.05);模型组大鼠关节滑膜组织中炎症细胞浸润明显,而GE中、高剂量组大鼠关节滑膜组织中炎性细胞浸润减少。炎症因子检测结果显示,GE中、高剂量大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-1α含量较模型组显著降低(p<0.05),GE中、高剂量组能够显著降低痛风关节炎大鼠体内的炎症因子水平,从而缓解痛风关节炎的症状。GE在大鼠急性痛风性关节炎发病时表现出积极的影响作用,并呈现出一定的剂量依赖性,本研究证实GE在抗急性痛风性关节炎方面有缓解作用,但其作用机制尚不明确,有待进一步研究。