GP-MSE/GC-MS分析夏枯草不同部位挥发性成分

杨 翠,赵锦花

(1.长春师范大学化学学院,吉林长春 130032; 2.长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林延吉 133002)

夏枯草(PrunellavulgarisL)为唇形科夏枯草属多年生草本植物,别名麦穗夏枯草、铁线夏枯草,麦夏枯、铁线夏枯、乃东等。夏枯草在我国分布广泛,以河南、安徽、湖南、江苏等省为主要产地[1-2]。夏枯草全草及其干燥果穗均可入药,味苦、性辛寒[3-4]。其药理活性广泛,主要为清热明目、泻肝火、利尿等[4-5]。夏枯草作为食品也被广泛使用,如可用于凉茶[6]、煲汤、凉拌等。

夏枯草主要含三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、苯丙素、有机酸、挥发油及糖类等成分[7-8]。目前,夏枯草集中于萜类、苷类及黄酮类等非挥发性成分提取与药理活性的研究成果报道较多[9-10],而对挥发油及其挥发性成分的报道较少[11-12]。杨超[11]报道夏枯草中发现16种挥发性成分,王海波[12]研究中发现17种挥发性成分。已有文献中检测到的挥发性成分均有限,且均是以全草进行研究,无法确定各部位特征成分,这将限制夏枯草挥发性成分的深入研究。

药用植物中挥发性成分的萃取方法主要有水蒸气蒸馏法[12]、超临界流体法[11]等,水蒸气蒸馏法存在提取率低,耗时且主要萃取低沸点物质等缺点[12];超临界流体法设备较昂贵,不利于广泛应用。气流吹扫微萃取法(GP-MSE)萃取挥发性成分具有快速(≤2 min),溶剂用量少且完全萃取等优点[13-15]。本研究利用GP-MSE对夏枯草挥发性成分开展系统性研究,建立夏枯草挥发性成分提取方法,并探讨其不同部位之间挥发性成分的异同,为其能够更好地在食品、药品中应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

夏枯草 2016年8月采自吉林省长白山;二氯甲烷 色谱纯,美国Fisher。

GC-MS plus 2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津;气流吹扫微萃取仪 实验室自行研制;100 μL衬管 安捷伦科技有限公司；FW-100高速万能粉碎机 天津泰斯特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 将新鲜夏枯草按根、枝、叶、花四部位对其进行剪裁,洗净后置于阴凉通风处自然阴干。利用FW-100高速万能粉碎机将干燥的夏枯草粉碎,并过200目筛,随后置于棕色样品瓶,-20 ℃存储,备用。

1.2.2 GP-MSE法挥发性成分的萃取 依据文献报道[13-15],具体步骤如下:准确称取夏枯草粉末样品5.0 mg,并置于样品槽中,随后安装气流吹扫微萃取仪;量取萃取溶剂二氯甲烷(50 μL)置于100 μL衬管(接收器)中;打开气流吹扫微萃取仪开关开始萃取;萃取后,利用二氯甲烷定容至100 μL,从中取2 μL进样分析。气流吹扫微萃取仪参数如下:氮气流速为2 mL/min,萃取温度为250 ℃,萃取时间为2 min,冷凝温度为-4 ℃。

1.2.3 GC-MS分析 GC条件:DB-5 MS毛细石英柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)被用于挥发油的分离,升温程序:45 ℃保持1 min,4 ℃/min升至250 ℃,6 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。载气He(纯度≥99.99%),载气(He)流速为0.98 mL/min。进样口温度280 ℃,进样量 2 μL,分流比50∶1。

MS条件:离子源EI,电子能量70 eV,离子源温度200 ℃,质谱接口温度200 ℃,扫描范围50～600 m/z,标准图谱库为NISTO8、NISTO8s谱库。

定性定量方法:计算机检索谱库和人工分析质谱图完成挥发性成分的定性;借助手动积分法,以峰面积归一化方法完成各组分的定量,计算各组分的相对含量。

1.3 数据分析

定性分析采用岛津GC-MS化学工作站NIST 10标准质谱图库检索完成,并与文献资料中图谱解析结果进行比较。定量分析利用手动积分方法对信噪比大于10的所有色谱峰进行积分,按面积归一化法计算出各化学成分的相对含量。

利用SPSS Statistics软件中主成分分析(PCA)方法完成数据统计分析。

2 结果与讨论

2.1 夏枯草中挥发性成分分析

夏枯草根、枝、叶、花中共检测到182个色谱峰,总离子流图见图1。每个部位检测到的挥发性成分分别为98、98、98、124个,通过标准谱库搜索定性组分各占总成分的66.53%、91.24%、89.32%和84.87%,夏枯草共定性145个成分,详细见表1。结果显示:根中含量最多的是正二十六烷(9.53%)、糠醛(9.12%)和二十八烷(5.77%);叶中主要含有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)和糠醛(10.74%);枝中以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)为主要成分;花中以正二十九烷(16.05%)、香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)为主要成分。通过分析发现根、枝、叶、花中共有成分有37种,根中含量最多的是糠醛(9.12%)和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(3.61%);叶中主要含有糠醛(10.74%)和2-呋喃甲醇(4.16%);枝中以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)为主要成分;花中以香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)为主要成分。此外,还检测到一些特有化学成分,如根特有成分17种,其中含量最高的为正二十八烷(5.77%);枝特有成分10种,其中含量最高的为亚油酸(4.52%)和5-乙酰氧基甲基-2-呋喃醛(1.46%),其他均小于1.00%;叶特有成分3种,且百分含量均小于0.2%;花特有成分8种,以正二十九烷(16.05%)含量最高,其他百分含量均小于0.4%。

图1 夏枯草不同部位挥发性成分总离子流程图Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in different parts of Prunella vulgaris

表1 夏枯草不同部位挥发性成分Table 1 Volatile components from different parts of Prunella vulgaris

续表

续表

按不同官能团比较分析通过定性分析发现所有挥发性成分都是C4～C36的化合物,包含酯类、醇类、醛类、酮类、酚类、烃类等。为了确定各部位主要贡献成分的类型,依据官能团的种类将所有挥发性成分进行分类,共分为10类。从表2可知,根中所含主要化合物的类型有醛类(20.66%)和酚类(13.23%),醛类中糠醛(9.12%)占绝对主导。叶中主要含有醇类(26.79%)和醛类(15.15%),其次酸类(9.66%)和酚类(8.07%),醇类以3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)为绝对主要成分,醛类以糠醛(10.74%)为主要贡献成分。枝中主要含有醛类(21.18%)和酚类(19.80%),而酮(13.83%)、醇(11.55%)、酸(9.39%)三类相差不多,醛类中糠醛为绝对主导成分,相对含量达9.99%,酚类以4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚(3.02%)和苯酚(2.42%)为主要成分。花中含量最多的成分是烷烃类(29.01%),其次是其他含氮和氧化合物(12.17%)、醇类(9.89%)和醛类(8.89%),烃类中正二十九烷(16.05%)为绝对主导成分。从表中可看出夏枯草根、枝挥发性物质的组成类似,叶、花中挥发性物质的组成与根和枝中的成分存在一定的差异。通过分析比较,发现4个不同部位挥发性成分中共同含有化学成分37种,其他还有一些特有成分。

表2 夏枯草不同部位各类官能团挥发性成分含量(%)Table 2 Functional groups of volatile components content in different parts of Prunella vulgaris(%)

2.2 按所有成分PCA分析

总离子流图显示夏枯草各部位均存在多种挥发性成分,但难以通过色谱图直观区分各部位成分的差异(图2)。全部成分定性定量后,从成分及含量表中仍难以直观区分四个部位。为此,本文借助统计学方法进行比较分析。

为了直观、准确判断夏枯草不同部位间的化学成分是否存在实质性差异,利用统计方法进行比较,本文采用主成分分析法(PCA),分别以所有成分及官能团分类数据作为变量,具体结果见图2和图3。在图2中第一个主成分(X-axis:PC1)占79.9%,第二个主成分(Y-axis:PC2)占13.8%。在图3中第一个主成分(X-axis:PC1)占55.3%,第二个主成分(Y-axis:PC2)占26.8%。两种作图方式中第一和第二主成分之和均大于80%。从图3中可直观判断每个部位的主要成分类型,比如根中主要是醛类和酚类;枝中主要是醛类、酚类、醇类和酮类;叶中主要是醇类和醛类;花中主要是烷烃类和其他(含N,O)类。图2和图3均可直观显示夏枯草挥发性成分在根和枝中差异很小,叶与根枝在成分上存在一定差异,主要是由于醇类物质引起的,而花中挥发性成分与其他部分存在明显差异,主要贡献成分也有很大不同。该研究结果显示,复杂的化学成分可利用统计分析方法将其简单化,进而为深入研究奠定基础。

图2 所有成分主成分分析图Fig.2 PCA diagram of all components

图3 全部成分的官能团分类主成分分析图Fig.3 PCA diagram of functional group classification of all components

3 结论

本文利用气流吹扫微萃取技术和GC-MS联用的方法对夏枯草不同部位挥发性成分进行定性定量分析,结果显示,共定性145种成分,其中有28种是根、枝、叶、花中共有的成分。根中含量最多的是正二十六烷(9.53%)、糠醛(9.12%)和二十八烷(5.77%);叶中主要含有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)和糠醛(10.74%);枝以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)为主要成分;花中以正二十九烷(16.05%)、香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)为主要成分。该方法能够定性更多的挥发性成分,进而为夏枯草的进一步开发利用提供技术支持。本文借助主成分分析法使分析结果更直观。本文深入研究了夏枯草不同部位间挥发性成分的差异,为夏枯草在食品、药品等领域应用提供基础数据支持。