一测多评法测定蜂胶类保健食品中咖啡酸等4种成分的含量

杨 玲,刘 齐,刘成浩,杨抒楠,韩萧茜,赵一芃,杜 勇

(北京市药品检验所,北京 102206)

蜂胶为蜜蜂科昆虫意大利蜂(ApismelliferaL.)工蜂采集的植物树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物。能够用于解毒消肿、收敛生肌、体虚早衰、高脂血症等[1]。根据国家食品药品监督管理局网站上的数据查询结果,截止到2018年9月30日,国产和进口保健食品中以蜂胶为原料的共有1459种,主要功效为提高免疫力、抗疲劳、调节血脂等。酚酸及其脂类是蜂胶的主要活性成分之一[2],阿魏酸可抗氧化、清除自由基、抗血栓、抗菌抗病毒、抑制肿瘤、降血脂、防治冠心病、保护DNA抗氧化活性等[3]。异阿魏酸和阿魏酸的功效相似,具有明显的解热、镇痛和抗炎作用,可以抑制多种炎症,而且毒性小,对胃肠道无刺激[4]。咖啡酸可以治疗化疗引起的白细胞下降,提高机体免疫机能,预防感染[5]。咖啡酸苯乙酯具有抑制癌细胞、抗氧化、抗炎、免疫调节等作用[6],均与其保健功效相符,可作为质控指标。

中国药典2015年版已经采用高效液相色谱法测定蜂胶中白杨素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和乔松素[1]。近年也有多篇文献报道采用UPLC、HPLC的方法同时测定蜂胶中多种黄酮及酚酸的含量[7-9]。但绝大多数以蜂胶为原料的保健食品都是采用测定总黄酮的含量作为质控方法,此类方法专属性差,精确度低,难以准确评估产品质量,同时增加了造假、使用替代原料的潜在风险。蜂胶中化学成分与有效成分的多样性、复杂性,使得测定单一的功效或指标性成分难以准确表达产品质量,只有尽可能对其中的多种有效成分或主要成分进行综合性评价,才能达到全面控制质量的目的。但是对照品供需矛盾和多指标质控高昂的检测成本反过来又限制了此种质量控制模式在实际生产、科研、监督中的应用。

一测多评法通常以一个对照品为参照物,建立该成分与其他成分间的相对校正因子,并通过它计算其他成分的含量,实现多成分的同时测定。该方法可以减少对照品的使用数量,降低检测成本,节约检测时间,在中药材、中成药及食品的质量评价中得到了应用[10-18],而以蜂胶为原料的保健食品数量众多,有必要建立一个科学、高效的质量控制方法。本研究参考文献[19-20]的技术要求,以期建立以异阿魏酸为参照物,HPLC法测定以蜂胶为单一原料的保健食品中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸及咖啡酸苯乙酯的“一测多评”检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

咖啡酸(批号:110885-201703)、阿魏酸(批号:110773-201614)、异阿魏酸(批号:111698-201103)及咖啡酸苯乙酯(批号:112024-201601) 均由中国食品药品检定研究院提供;甲醇为色谱纯 默克股份两合公司;磷酸 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;水 自制重蒸馏水;测定用样品 市售蜂胶类保健食品,均为蜂胶软胶囊。

岛津LC-20AD高效液相色谱仪(方法学考察所用) 日本岛津制作所;Waters e2695高效液相色谱仪 沃特世公司;Aglient-1100高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;XS-205电子分析天平 梅特勒-托利多集团;SB-25-12D超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合对照品溶液制备 精密称取咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸及咖啡酸苯乙酯对照品适量,加甲醇制成质量浓度分别为15.09、10.00、20.02、60.72 μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品提取条件的优化

1.2.2.1 提取溶剂的选择 参考文献提取方法[7-8],取编号001的蜂胶软胶囊样品内容物,混匀,精密称取0.5 g,分别以乙醇、75%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、水为提取溶剂,超声处理30 min,分别进样,以峰面积为纵坐标,提取溶剂为横坐标,制作柱形图,比较最优提取结果,确定提取溶剂。

1.2.2.2 提取时间的选择 确定提取溶剂后,采用最优提取溶剂进行提取,考察15、30、45 min 3种提取时间对峰面积的影响,分别进样,以峰面积为纵坐标,提取时间为横坐标,制作柱形图,确定最佳提取时间。

1.2.3 供试品溶液制备 取蜂胶软胶囊内容物,混匀,精密称取0.5 g,置于50 mL容量瓶中,加70%甲醇适量溶解,超声处理(功率500 W,频率40 kHz),冷却后用70%甲醇定容至刻度,摇匀。以0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:资生堂UG120(方法学考察所用),Kromasil 100-5-C18,Aglient ZORBAX SB-C18,规格皆为柱长250 mm,内径4.6 mm,粒径5 μm;流动相甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(洗脱程序见表1);检测波长为320 nm;柱温30 ℃;流速为:1.0 mL/min,进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液各10 μL进样,记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标(Y),对照品浓度为横坐标(X)进行线性回归,计算回归方程。

1.2.5.2 相对校正因子的计算 本研究采用以多个质量浓度点计算所得的fsi取平均值作为定量用fsi。计算公式为:fsi=(As×Ci)/(Ai×Cs),公式中fsi为相对校正因子,As为参照物对照品s峰面积,Cs为参照物对照品s浓度,Ai为待测成分对照品i峰面积,Ci为待测成分对照品i浓度。

1.2.5.3 相对保留时间的确定 取混合对照品溶液进样,记录4种成分的保留时间,并分别计算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对保留时间。计算公式:ras=tRa/tRs,tRa为待测成分的保留时间,tRs为内参物的保留时间,ras为二者的比值即相对保留时间。

1.2.5.4 精密度试验 取同一混合对照品溶液,连续进样6次,记录各成分色谱峰峰面积,并计算RSD值。

1.2.5.5 稳定性试验 取编号为001的样品,按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于制备后0、4、8、12、24 h注入液相色谱仪,记录各成分峰面积,并计算RSD值。

1.2.5.6 重复性试验 取编号为001的样品,按照“1.2.3”项下方法制备6份供试品溶液,进行测定,计算咖啡酸等4种成分的含量,并计算RSD值。

1.2.5.7 回收率试验 取编号为001的样品,精密称定9份,每份0.25 g,分成3组,每组3份,分别精确添加含咖啡酸1.119 mg/mL的对照品溶液0.15、0.30、0.45 mL,含阿魏酸0.1123 mg/mL的对照品溶液0.4、0.8、1.2 mL,含异阿魏酸1.008 mg/mL的对照品溶液0.15、0.30、0.45 mL,含咖啡酸苯乙酯1.033 mg/mL的对照品溶液1.0、3.0、4.0 mL,按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,并测定,分别计算回收率。

1.2.5.8 系统耐用性考察 精密吸取混合对照品溶液,进样分析,计算以异阿魏酸为参照物的其余3种成分相对校正因子及相对保留时间。分别采用3台不同品牌的高效液相色谱仪(其余2台为Waters e2695高效液相色谱仪;Aglient-1100高效液相色谱仪),3根不同型号的色谱柱(其余2根为Kromasil 100-5-C18,Aglient ZORBAX SB-C18),及在同一台高效液相色谱仪(岛津LC-20AD高效液相色谱仪)上选择3种不同的柱温和3种不同的流速进行测定。

1.2.6 一测多评法与标准曲线法的测定结果比较 取以蜂胶为单一原料的保健食品6批,按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,测定,并采用标准曲线法和一测多评法分别计算咖啡酸等4种成分的含量。

1.3 数据处理

利用Excel软件进行数据统计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 对照品及样品的色谱图

对照品及样品的HPLC色谱图如图1所示。图1中可以看出,峰1～4分别为咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯,4种成分能够明显分离开来。

图1 对照品HPLC色谱图(A),供试品HPLC色谱图(B)Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B)注:1.咖啡酸;2.阿魏酸;3.异阿魏酸;4.咖啡酸苯乙酯。

2.2 提取方法的优化结果

2.2.1 提取溶剂的选择 图2为提取溶剂对4种成分峰面积的影响结果。从图2中可以看出,以70%甲醇为提取溶剂时,各成分峰面积均为最大值,故选择70%甲醇为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对4种成分峰面积的影响Fig.2 Effect of different extracting solvents on peak area of four components

2.2.2 提取时间的选择 图3为提取时间对4种成分峰面积的影响。从图3中可以看出,咖啡酸、阿魏酸的峰面积随提取时间的延长无明显变化,异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯在超声提取30 min时,峰面积最高,超声时间增加至45 min时,峰面积比30 min时略低。综上选择30 min为超声提取最佳时间。

图3 不同提取时间对4种成分峰面积的影响Fig.3 Effect of different extracting time on peak area of four components

2.3 方法学考察结果

2.3.1 线性关系 按“1.2.5.1”项下进行试验,结果表明,咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯在0.5030～25.15、0.1000～20.00、0.5005～80.08、2.024～202.4 μg/mL范围内线性关系良好,相关系数均为0.9999,结果见表2。

表2 4种成分的标准曲线Table 2 Stand curve of four components

2.3.2 相对校正因子的计算 本研究中以异阿魏酸为参照物,根据不同进样量分别计算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对校正因子,并求平均值作为最终结果,结果见表3。由表3可知,咖啡酸3种成分的相对校正因子分别为0.9503、0.9276、1.3902。

表3 咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对校正因子Table 3 Relative correcting factors of caffeic acid,ferulic acid and phenethyl caffeate

2.3.3 相对保留时间的确定 色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提。本研究中,咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的化学性质比较稳定,对照品来源有保证,作为参照物均可满足方法的要求,进行相对保留时间考察时发现,异阿魏酸为第3个出峰,保留时间相对居中,以此为参照物计算其余3种成分的相对保留时间的误差较小,故选择其为参照物。本研究以异阿魏酸为参照物,分别计算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对保留时间,咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对保留时间分别为0.594、0.914、2.670,可作为试验中3种成分的定位依据,见表4。

表4 4种成分相对保留时间Table 4 Relative retention time of 4 components

2.3.4 精密度试验 按“1.2.5.4”项下进行精密度试验,结果见表5。由表5可知,咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯峰面积的RSD分别为0.1%、0.1%、0.1%、0.1%,表明仪器精密度良好。

表5 4种成分精密度试验结果Table 5 Results of precision test of 4 components

2.3.5 稳定性试验 按“1.2.5.5”项下进行稳定性试验,结果见表6。由表6可知,咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯峰面积的RSD分别为1.2%、0.9%、0.8%、1.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表6 4种成分稳定性试验结果Table 6 Results of the stability of 4 components

2.3.6 重复性试验 按“1.2.5.6”项下进行重复性试验,咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸苯乙酯含量测定结果见表7。由表7可知,RSD分别为1.3%、2.0%、1.1%、0.9%,表明该方法重复性良好。

表7 重复性试验结果Table 7 Results of reproducibility test

2.3.7 回收率试验 按“1.2.5.7”项下进行回收率试验,结果见表8。由表8可知,咖啡酸等4种成分的平均加标回收率在99.85%～101.69%之间,RSD为1.7%～2.3%,表明各成分回收率良好。

表8 加样回收率测定结果Table 8 Results of recovery test

续表

2.3.8 系统耐用性考察 按“1.2.5.8”项下进行试验,更换仪器和色谱柱后,相对校正因子结果见表9～表13。由表9～表13可知,相对校正因子的重现性良好,RSD为1.1%～3.5%,表明该方法可适用于不同的色谱系统及不同的色谱柱。另在同一色谱系统中采用不同的流速和柱温进行试验,相对校正因子的重现性良好,RSD为0.4%～1.1%,表明该方法可适用于不同的试验环境。另外,更换不同的色谱柱后,考察3种成分的相对保留时间,RSD为0.5%～2.8%,表明使用不同的色谱柱,相对保留时间变化幅度较小,可准确定位。

表9 不同色谱柱测得相对校正因子Table 9 Relative correcting factors determined by different columns

表10 不同仪器测得相对校正因子Table 10 Relative correcting factors determined by different instruments

表11 不同流速测得相对校正因子Table 11 Relative correcting factors determined by different velocity

表12 不同柱温测得相对校正因子Table 12 Relative correcting factors determined by column temperature

表13 不同色谱柱的相对保留时间Table 13 Relative retention times determined by different columns

2.4 一测多评法和标准曲线法的样品测定结果比较

采用标准曲线法和一测多评法分别计算6批样品中咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的含量,结果见表14。标准曲线法和一测多评法测定结果相对平均偏差(RAD)在0.1%～1.7%之间,表明其测定结果基本一致。

表14 样品测定结果Table 14 Results of sample determination

3 结论

本研究建立了以蜂胶为单一原料的保健食品中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸及咖啡酸苯乙酯的一测多评检测方法,以异阿魏酸为参照物,进行一测多评,并且对比了一测多评法和标准曲线法的测定结果。结果表明,蜂胶中4种成分在相应的线性范围内线性关系良好,相关系数r>0.9999,精密度、稳定性、重复性试验的RSD在0.1～2.0%之间,加标回收率在99.85%～101.69%,RSD为1.7%～2.3%,咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相对校正因子分别为0.9503、0.9276、1.3902,相对保留时间分别为0.594、0.914、2.670,且在不同实验条件下重现性良好,一测多评法计算值与标准曲线法实测值相对平均偏差在0.1%～1.7%之间,测定结果基本一致,可以实现以异阿魏酸为参照物,对蜂胶中4种成分的含量同时进行测定。