猪流行性腹泻诊断方法研究进展

摘要：猪流行性腹泻是一种由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒引起的肠道病毒传染病，病猪主要表现为呕吐、腹泻和脱水，仔猪患病导致生长发育受阻，并且有很高的死亡率，加强猪流行性腹泻病毒的诊断对疾病防控的作用至关重要，该文主要介绍猪流行性腹泻诊断方法的最新研究进展，为猪流行性腹泻病毒的综合防控提供技术支持。

关键词：猪流行性腹泻;诊断方法;研究进展

中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.20.052

0 引言

猪流行性腹泻病毒是冠状病毒科冠状病毒属成员，是单股、正链的RNA病毒，猪流行性腹泻病毒只有1种血清型，对外界环境和消毒药抵抗力不强。猪流行性腹泻病毒主要通过接触感染，病毒主要在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行复制。猪流行性腹泻病毒在寒冷季节高发，不同日龄的猪均易感，仔猪感染后死亡率更高，成年猪死亡率较低，主要是引起呕吐和厌食。病猪是主要传染源，病毒可污染饲料、饮水造成病毒在猪舍快速传播，猪流行性腹泻病毒的主要诊断方法包括以下几种。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法是疾病检测最常用的方法，通过设计猪流行性腹泻病毒的特异性检测引物，提取病毒的核酸基因组，在合适的扩增反应条件下对病毒基因组片段进行特异性扩增，通过观察扩增片段的大小进行疾病诊断。韩昊莹[1]等根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒疫苗株ORF3基因序列，在245～293位缺失区域两侧设计并合成1对特异性引物，建立了快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的RT-PCR方法，该方法敏感性高，对猪流行性腹泻病毒野毒株、疫苗株可分别扩增出长度为282 bp和233 bp的特异性片段最低检测下限分别为455 coies/μL和396 coies/μL，该方法特异性好，对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪伪狂犬病毒核酸扩增均为阴性，该方法不仅可用于猪流行性腹泻病毒的检测，还可区别猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株，为猪流行性腹泻病毒防控提供有效地技术保障。

2 巢式RT-PCR方法

巢式RT-PCR方法是在普通RT-PCR方法的基础上增加一轮PCR扩增，通常设计2套检测引物，在第1轮扩增结束后利用第1次扩增的引物进行第2轮PCR扩增，该检测方法敏感性更高，特异性更强。邓祖丽颖[2]等根据GenBank中猪流行性腹泻病毒基因组序列，在M基因的内、外设计2对特异性检测引物，通过优化反应条件，建立猪流行性腹泻病毒的巢式RT-PCR检测方法，该巢式RT-PCR检测方法最低可检测50fg猪流行性腹泻病毒RNA模板，与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒没有交叉反应。巢式RT-PCR检测方法特异性强，敏感性高，适用于微量猪流行性腹泻病毒核酸的检测。

3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR方法是设计多个疾病检测引物，在一次PCR反应中加入所有引物，实现对多种病原体的检测。王睿敏[3]等分别参照猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒的基因序列设计特异性检测引物，预期扩增片段大小分别为750、544、183和329bp，通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化，成功建立猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒的多重RT-PCR检测方法，该检测方法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒的检测结果为阳性，四种病毒重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10、1.57×10、1.57×10、1.57×10coies/L，对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪细小病毒等的扩增均为阴性。多重RT-PCR检测方法可以用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒的快速鉴别检测及流行病学调查。

4 熒光定量RT-PCR方法

荧光定量RT-PCR检测方法是在RT-PCR方法的基础上引入荧光标记技术，通过实时监测荧光强度实现对病毒核酸扩增的定量检测，该检测方法的敏感性更好。王以欣[4]等猪流行性腹泻病毒的N基因为靶基因，基于双启动寡核苷酸引物（DPO），经过条件优化，建立了基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法，该检测方法DPO引物的有效退火温度是45～65℃，PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10coies/μL，敏感性高，与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%，为猪流行性腹泻病毒的准确检测和流行病学调查提供技术支持。

5 RT-LAMP方法

环介导等温扩增RT-LAMP检测方法是一种等温核酸扩增技术，该检测方法的优点是操作方便，不需要特殊仪器设备，常温水浴锅可以进行扩增，非常适合临床现地应用。邵建宏[5]等建立荧光RT-LAMP法检测猪流行性腹泻病毒，该方法根据猪流行性腹泻病毒核蛋白基因序列设计一套特异性LAMP引物，该检测方法特异性强、灵敏度高、检测速度快，可广泛应用于猪流行性腹泻的快速筛查及实验室检测，为猪流行性腹泻的早期诊断和治疗提供技术支持。

6 结束语

猪流行性腹泻病毒对养猪业危害巨大，该病传播迅速，猪群普遍易感，一旦发病、难以阻断，疾病的快速准确的早期诊断对其综合防控起到关键作用，只有综合运用各种检测方法，积极开展猪流行性腹泻病毒的诊断和流行病学调查，为猪流行性腹泻病毒的临床诊治提供合理的科学依据。临床可根据需要采用不同的检测方法，如单纯猪流行性腹泻病毒感染可采用普通的RT-PCR检测方法，对检测结果的灵敏度要求较高的可采用荧光定量PCR检测方法和巢式PCR检测方法，几种疾病混合感染的可采用多重PCR检测方法，临床现地应用时可以采用LAMP检测方法，可根据自身试验条件及检测的目的和要求运用合适的检测方法或者综合运用多种检测方法，为猪流行性腹泻病毒的综合防控提供技术支持。

参考文献

[1]韩昊莹，郑慧华，赵宇，等.鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株RT-PCR方法的建立[J].河北农业大学学报，2018，41（2）：84-88.

[2]邓祖丽颖，陈陆.猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：34-37.

[3]王睿敏，施开创，黎宗强，等.猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2019，49（2）：190-198.

[4]王以欣，王紫薇，汉武娇，等.基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报，2019，41（7）：710-715.

[5]邵建宏，曾俊霞，赵福振，等.荧光RT-LAMP法检测猪流行性腹泻病毒方法的建立[J].广东畜牧兽医科技，2019，44（2）：42-45，52.

作者简介：孙梅（1977-），女，山东平邑人，兽医师，研究方向：临床兽医。