DAPK的亚细胞定位及其对细胞器功能的影响

杨鑫柳 牛海涛 王清水 林尧

摘要：死亡相关蛋白激酶（DAPK）是一种钙离子/ 钙调素调节的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞进程，如：自噬、凋亡和细胞迁移等。DAPK 作为一种抑癌基因，与肿瘤的发生、发展及患者预后密切相关。本文主要概述了 DAPK 的亚细胞定位及其对细胞器功能的影响。

关键词：死亡相关蛋白激酶（DAPK）;亚细胞定位;肿瘤

【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）05-024-03

1995 年，以色列学者 Deiss 等首次发现一种细胞凋亡正调控因子：死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）[1]。DAPK 是一種钙离子 / 钙调素调节的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶。作为一种抑癌基因，DAPK 参与了多种细胞进程，如：自噬、凋亡和细胞迁移等 [2]，提高DAPK 的活性能够导致细胞出现死亡的特征，包括膜泡生成、细胞变圆、细胞外基质脱离和自噬小泡的形成 [3]。研究发现 30% 膀胱癌、乳腺癌和肾细胞癌的细胞系及 70%β 细胞淋巴瘤和白血病细胞系中 DAPK 的 mRNA 与蛋白表达水平处于较低水平 ， 而 DAPK 在人和大鼠的组织中广泛地表达 [4]。DAPK 作为一个大分子蛋白质，能够参与细胞内各种细胞器的生理进程，从而行使其抑癌基因的功能，本文就 DAPK 的亚细胞定位及其对细胞器功能的影响进行综述 。                                                                                             1.DAPK 的结构特点

DAPK 基因位于人类第 9 条染色体 q34.1， 转录成熟的

mRNA 为 5.9kb，编码的蛋白分子量为 160Kd， 目前 DAPK 家族至少有 5 个成员：DAPK、DRP-1/DAPK2（ DAPK 相关蛋白 /DAPK- related protein kinase） 、DLK/ZIPK（ 死亡相关蛋白样激酶 / 链接相互作用蛋白激酶 ， DAP like kinase/zipper interacting protein kinase） 、DRAK1（ DAPK 相关蛋白诱导激酶 1） 和 DRAK2 （ DAPK 相关蛋白诱导激酶 2）。五个成员的 C 端各不相同 [5]，但 DRP-1/DAPK2、DLK/ZIPK 和 DAP like kinase/zipper 的激酶区同 DAPK1 相比有 80% 同源性， 而 DRAK1、DRAK2 的激酶区同 DAPK1 相比只有 50% 同源性。

DAPK1 含有几个不同的功能域 ， 依次为：激酶区， 钙调素调节区，8 个连续的锚蛋白重复序列，包含 2 个潜在核苷酸结合位点的 ROC-COR（Ras of complex proteins， C-terminal of ROC）区，死亡结构域与富含丝氨酸的尾巴。DAPK1 核心激酶区高度保守，保守的赖氨酸残基同 ATP 的结合极为重要;钙调素调节区 308 位点的丝氨酸的磷酸化可抑制了钙调素白结合，从而抑制 DAPK1 活性;8 个锚蛋白重复序列保证 DAPK1 定位在肌动蛋白微丝上;ROC- COR 结构域促进 GTP 水解，调节 DAPK1 催化活性，且ROC-COR 片段也可能促进与其他 ROCO 家族蛋白的结合介导细胞功能;死亡结构域可以参与肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和死亡受体 Fas 等诱导的细胞凋亡，还可以起到调节 DAPK 稳定性的作用;删除富含丝氨酸的尾巴可增强 DAPK1 诱导的细胞膜泡形成，但对体外肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化无影响 [6]。

因此 DAPK1 的激酶区域、钙调蛋白结合区域和 ROC- COR 区参与DAPK1 的功能活化。它们决定DAPK1 的作用底物 ， 是主要的调节区域和蛋白激酶抑制剂靶点。DAPK1 的 8 个连续的锚蛋白重复序列、死亡结构域与富含丝氨酸尾巴的区域无催化活性 ， 但是对于 DAPK1 正确的亚细胞定位及参与蛋白质的相互作用具有重要作用。

细胞内部的膜的将细胞分隔成为一个个独立的区室化空间 ， 保证了细胞内各项生理活动高效稳定的运行。有研究表明，蛋白质异常的亚细胞定位可能与多种人类疾病相关，比如：阿尔茨海默病，肾结石和肿瘤 [7]。因此研究DAPK 蛋白的亚细胞定位及其如何参与各种细胞器功能并发挥作用，对于揭示其功能机制及肿瘤疾病治疗具有非常重要的作用。

1.1 DAPK 与细胞骨架

细胞骨架是真核细胞由微管、微丝、中间丝组成的蛋白纤维网状结构 [8]。细胞骨架能够维持细胞基本的形态结构，参与细胞多种生理进程，如迁移和凋亡等。细胞骨架的重组装使凋亡细胞形态发生變化，微丝、中间丝及微管结构发生解聚重构，包裹细胞器形成凋亡小体，诱导细胞发生凋亡 [9]。

Kuo JC 等报道 [10]DAPK1 同肌球蛋白轻链激酶 （MLC） 的接触中心有 44% 同源性，体内肌球蛋白轻链是 DAPK1 磷酸化底物 ， 而 MLC 的磷酸化导致细胞膜出现膜泡，因此DAPK1 可能与细胞膜膜泡发生有关。

Bialik S 等 [11] 设计融合有绿色荧光蛋白的 DAPK1 转染至细胞中观察 DAPK 的细胞定位及其对细胞形态的影响， 发现 DAPK1 部分定位于肌动蛋白细胞骨架上，尤其是应力纤维，其表达与体内肌球蛋白Ⅱ调节轻链上 Ser-19 的磷酸化有关。缺乏 ROC-COR 结构域的突变体表现为弥漫在细胞质中，并诱导周围膜滤泡，而不是广泛的膜突起。相反， 锚蛋白重复序列的缺失会导致激酶定位发生改变。

Houle F 等报道[12]H2o2 诱导ERK 下游DAPK1 的激活， 而 DAPK1 在体内外能够促进肌球蛋白 -1 在 283 位丝氨酸的磷酸化，这种磷酸化对于 H2o2 诱导内皮细胞肌动蛋白应力纤维的形成是至关重要的，因此 DAPK1 可以作为肌球蛋白 -1 调节内皮细胞骨架重塑的上游蛋白。

1.2 DAPK 与内质网

内质网 （ endoplasmic reticulum，ER） 是真核细胞中一个大的膜包围的细胞器，主要负责蛋白的合成、折叠、修饰及转运。同时 ER 也是主要的胞内 Ca2+ 储存库。在某些生理和病理条件下引起未折叠蛋白聚集在内质网中，引起内质网应激，内质网应激过强或过长，则会导致内质网的内稳态和 Ca2+ 严重失调，引起细胞凋亡自噬 [13]。

Gozuacik D 等报道 [14] DAPK1 可作为 ER 应激诱导细胞凋亡自噬途径的重要调节蛋白，DAPK1 的催化活性通过ER 应激信号而增强，DAPK1 的缺失导致凋亡和自溶作用均减弱，使细胞免于 ER 应激诱导的细胞死亡。

Mebratu YA 等研究报道 [15]Bcl-2 相互作用杀伤蛋白（Bik）能够促进DAPK 蛋白同细胞外调节蛋白激酶（ERK）、 Bcl-2 同源杀伤蛋白（Bak）结合形成复合体，同时 Bik 蛋白能够提高Bak 蛋白的表达，使其大量的定位在内质网上， 内质网上的 Bak 蛋白能够使 DAPK 锚定在内质网上并促进内质网和线粒体的结合，加速内质网上钙离子的释放和线粒体钙离子的积累，从而激活下游 caspase 诱导的细胞死亡。

Zhou Y 等报道 [16] 在喹烯酮诱导的细胞自噬过程中， 活化转录因子 6（ATF6）和 DAPK1 的表达和转录水平随着喹烯酮处理的时间和剂量的增加而提高，同时喹烯酮能够诱导由 DAPK1 介导肌球蛋白调节轻链（MRLC）的磷酸化，从而激活哺乳动物 Atg9（mAtg9） 的自噬小泡转运。而用喹烯酮处理敲除 ATF6 和 DAPK1 的细胞系时，发现自噬作用降低。因此喹烯酮能够通过 ATF6 上调DAPK1 的表达， 从而激活肌球蛋白Ⅱ磷酸化介导的 mAtg9 蛋白进行转运， 从而造成 ER 应激，引起细胞自噬。

1.3 DAPK 与线粒体

线粒体普遍存在于除哺乳动物成熟红细胞以外的所有真核细胞中 [17]，是细胞进行能量转换和生物氧化的主要场所，线粒体在肿瘤细胞的代谢、凋亡、活性氧生成、钙稳态等多种进程中发挥着关键性作用，线粒体功能紊乱影响着肿瘤的发生发展 [18]。

Jang CW 等报道 [19]，转化生长因子 -β 依赖的凋亡对体内正常组织中受损或异常细胞的清除起着重要作用，而DAPK1 是转化生长因子 -β 凋亡途径的重要组成部分， 转化生长因子 -β 能够通过 Smad 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein） 激活诱导 DAPK1 的表达， 敲弱 DAPK1 可以抑制转化生长因子 -β 引起的细胞凋亡， 而单独转染 DAPK 的激酶区时，发现可以阻止线粒体细胞色素 c 的释放，进而减弱转化生长因子 -β 诱导的线粒体损伤，表明 DAPK 是线粒体促凋亡的上游调节蛋白。

DAPK2 是 DAPK 家族的五个成员之一，Schlegel CR 等报道 [20] 能够发挥代谢和调节线粒体的作用，DAPK2 的耗竭使线粒体内的 SOD2 的量大于胞质中 SOD1 时，线粒体内的活性氧水平得到升高，从而诱导超氧化物歧化酶

（SODS）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化 / 激活 ， 造成线粒体的氧化应激。同时沉默 DAPK2 发现可刺激线粒体自发去极化。线粒体的氧化应激和去极化造成线粒体功能代谢紊乱，功能失调的线粒体不再为细胞提供动力 ， 进而导致线粒体的降解与凋亡的发生。

DLK/ZIPK 同样是 DAPK 家族的五个成员之一，Kogel D 等报道 [21] 过表 DLK/ZIPK 能够诱导野生型细胞周期抑制因子（p19ARF）和 p53 的大鼠成纤维细胞凋亡，主要特征为凋亡膜泡生成、线粒体去极化、细胞色素 c 释放和caspase-3 的激活。p19ARF 缺乏和 p53 缺乏的小鼠成纤维细胞中也有 DLK/ZIPK 介导的细胞死亡。p53 的缺失并不能阻止 DLK/ZIPK 诱导的线粒体膜去极化和细胞色素 C 的释放，而且 DLK/ZIPK 的过表达也不会促进 p53 表达，因此DLK/ZIPK 能够独立于 p19ARF/p53 信号通路而触发线粒体凋亡通路。

1.4 DAPK 与溶酶体

溶酶体是存在于真核细胞中的单细胞膜细胞器，它体内包含有多种水解酶，可分别将脂肪、蛋白质、核酸降解为小分子物质。细胞自噬是依赖于溶酶体途径降解无用、错误折叠及多余的蛋白或细胞器，为细胞提供能量和合成原料 [22]。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体 1（mTORC1）在被体内的生长因子、营养及能量等信号激活后，能加速细胞内蛋白质的合成，为肿瘤细胞的生长提供物质基础 [23] 。

DAPK1 是 mTORC 的上游正调控蛋白，有研究表明 [24] 结节性硬化症蛋白 2（TSC2）可以同 DAPK1 的死亡结构域结合并被磷酸化，从而通过溶酶体途径负调控 DAPK1。另有研究 [25] 指出在多种细胞压力下，细胞体内能够自行调节TSC2 蛋白的亚细胞定位，使其定位于到溶酶体上从而抑制mTORC1 的活性，因此，DAPK1 可能受 TSC2 的影响定位于溶酶体上并参与溶酶体降解途径

目前针对肿瘤患者病理学的研究及肿瘤细胞实验中发现 DAPK 在肿瘤细胞功能上扮演着重要角色。Inbal 等 [26] 最早发现 DAPK 与肿瘤转移有关，他们将 DAPK 基因转染至高转移性肿瘤细胞中，待肿瘤细胞 DAPK 表达基因恢复正常水平时，将其注射到同基因型小鼠中发现能够延缓高转移性肿瘤细胞的转移能力。Kuo 等 [27] 发现 DAPK 能够干扰踝蛋白和整合素的结合，抑制肿瘤细胞的发展与转移， 同时 DAPK 在 CL1-5 细胞中的高表达抑制肿瘤的侵袭，而在 CL1-0 细胞中的低表达则促进肿瘤的侵袭。但 DAPK 表达的改变并不能显著影响两种细胞的增殖和存活。张海涛等 [28] 将 DAPK 基因转染到高转移性 PGCl3 后发现 DAPK 基因能够抑制该细胞的侵袭、运动和粘附能力。同时临床资料也进一步发现 DAPK 与肿瘤的发生和侵袭相关，Simpson 等 [29] 报道在 17 例侵袭性细胞中发现有 15 例肿瘤细胞中DAPK 表达缺失，与之形成对比的是 15 例非侵袭细胞中只有 1 例出现 DAPK 表达缺失。因此，DAPK 的發现对于研究肿瘤细胞功能提供了一个新的视角，但是基于肿瘤的复杂性，未来仍需进行大量的研究。

目前针对 DAPK 蛋白的研究主要集中在肿瘤细胞中的相关分子信号通路与组织、细胞差异表达的检测，关于

DAPK 蛋白的亚细胞定位及参与各种细胞器的功能的报道相对有限，开展 DAPK 蛋白的定位及其对细胞器功能影响的研究，将有助于拓展 DAPK 蛋白在肿瘤的发生、发展、浸润和转移等机制。同时目前针对 DAPK 蛋白的抗肿瘤药物的研发更多的是针对该蛋白的活性和启动子甲基化，未来如能结合 DAPK 的亚细胞定位及其对细胞器功能影响的相关研究，可能有机会成为今后肿瘤靶向治疗以及治疗后效果评估的可行途径。

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通讯作者：林尧，yaolin@fjnu.edu.cn

基金项目：福建省自然科学基金（2018J01723）