可口革囊星虫多糖酶法—碱梯次提取工艺优化及其抗氧化和抑菌性能分析

付满　黄海　杨泞清　覃媚　石展娴

摘要：【目的】优化可口革囊星虫多糖酶法—碱梯次提取工艺，并分析两阶段提取多糖的体外抗氧化和抑菌活性，为可口革囊星虫酶解产物及不溶性虫体成分的梯次化加工利用提供参考依据。【方法】以新鲜可口革囊星虫为材料、多糖提取率為考察指标，经木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶处理，联合酶解和滤渣碱提工艺，两阶段梯次化提取多糖，并测定可口革囊星虫多糖对DPPH自由基和羟基自由基（·OH）的清除率，采用纸片法测定其抑菌性能。【结果】可口革囊星虫多糖酶法—碱梯次提取最佳工艺为：复合酶（木瓜蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶2）添加量4.0%、酶解温度55 ℃、酶解时间4 h、料液比1∶5（g/mL）、滤渣碱提时间2.0 h、氢氧化钠浓度1.5%，在此条件下，获得酶解多糖提取率为1.076%，滤渣碱提多糖提取率为0.171%，总多糖提取率为1.247%。酶提多糖和滤渣碱提多糖对·OH清除的半抑制浓度（IC50）分别为2.6和4.9 mg/mL，清除DPPH自由基的IC50分别为4.4和5.1 mg/mL。酶提多糖和碱提多糖在1.560 mg/mL以上对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用。【结论】采用优化的酶法—碱梯次提取工艺可从可口革囊星虫酶解液和滤渣中有效提取多糖，且两种多糖均具有较强的抗氧化活性和抑菌作用。

关键词： 可口革囊星虫;多糖;酶法提取;滤渣碱提;抗氧化活性;抑菌性能

中图分类号： S917.4                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-1085-08

Abstract：【Objective】Extraction technology of enzymatic extraction of polysaccharides（EEP） and alkali extraction of polysaccharides from filter residues（AEPR） were studied by enzymolysis-alkali extraction from Phscolosoma esculenta. The antioxidant in vitro and antimicrobial activities of two-stage extraction of polysaccharides were tested. It provided reference for gradient processing of enzymatic hydrolysate and insoluble component of P. esculenta. 【Method】Taking fresh P. esculenta as material， the extraction rate of polysaccharides was used as index while two-stage extraction of polysaccharides were extracted by enzymatic process of papain and alkaline protease combining with alkaline process of enzymatic hydrolysis residue. The DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl（·OH） scavenging rate were detected，the antimicrobial properties were determined by paper disc method. 【Result】The results showed that the optimum extraction process for enzymolysis-alkali echelon extraction of polysaccharides was： complex enzyme（papain∶alkaline protease=1∶2） adding amount was 4%， enzymolysis temperature was 55 ℃， enzymolysis time was 4 h， solid-liquid ratio was 1∶5（g/mL）， residue alkaline extraction time was 2.0 h， concentration of alkali was 1.5%， the extraction rate of the EEP was 1.076%， the extraction rate of the AEPR was 0.171%， and the total polysaccharide was 1.247% . Half-inhibitory concentration（ IC50） of EEP and AEPR on ·OH were 2.6 and 4.9 mg/mL， respectively， and the scavenging rate IC50 of DPPH free radical were 4.4 and 5.1 mg/mL. EEP and AEPR had certain inhibitory effects on Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis at the concentration of more than 1.560 mg/mL. 【Conclusion】The optimized enzymolysis-alkali echelon extraction of polysaccharides can extract polysaccharides from enzymatic hydrolysate and filter residue of P. esculenta， and the two polysaccharides have strong antioxidant activity and antimicrobial activity.

Key words： Phscolosoma esculenta; polysaccharide; enzyme extraction; filter residue alkali extraction; antioxidant activity; antimicrobial activity

0 引言

【研究意义】可口革囊星虫（Phascolosoma esculenta）俗称海泥虫、海丁、泥蒜、泥丁、土笋等，属星虫动物门，是我国的特有种，也是我国星虫中较庞大的种群，主要分布于福建、广西、浙江、广东等沿海滩涂区域（李凤鲁，1989;李永强，2011;王帅，2018），可规模化增值养殖（徐敏娴等，2011），是一种具有开发前景的经济动物资源。可口革囊星虫对环境适应性强，在生长中可以抵抗滩涂复杂的微生物环境（王芳芳，2013;莫新，2017），其体内有益于这种防御作用的抗氧化和抑菌成分应被广泛关注和研究。已有研究表明可口革囊星虫多糖具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫力、抗败血症等功效（吴雅清等，2015）。因此，系统研究可口革囊星虫多糖的综合提取工艺及抗氧化和抑菌性能，对其天然活性成分的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】关于可口革囊星虫成分及活性功效方面已有一些研究报道。黄岛平等（2012）对北部湾可口革囊星虫进行研究，发现其在氨基酸和矿物质风味及营养评价方面的食用价值不低于方格星虫;牛荣丽和唐健红（2012）研究发现可口革囊星虫虫体经组织匀浆后制成的冻干粉悬浮液对小鼠具有明显的抗疲劳作用;孔帅（2014）研究发现可口革囊星虫多糖主要由葡萄糖和半乳糖，以及少量甘露糖和阿拉伯糖组成，具有一定的抗氧化作用和增强小鼠免疫功能;孔帅等（2014）利用蛋白酶水解提取可口革囊星虫多糖，其提取率为0.879%。部分动物多糖除了具有一定的抗氧化作用外，在抑菌性能方面也有一些研究报道，尤其是水产动物中由于其生存环境和特殊的机体结构，提取的结构多糖通常具有一定抑菌性能（丁侃，2018）。王冲（2005）研究认为蚯蚓体表粘多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、植物病原菌等多种菌体具有一定的抑菌作用;董兰芳等（2013）研究发现不同提取条件的方格星虫多糖具有不同的抑菌性能;田振华等（2013）、张瑞娟等（2018）分别发现牡蛎多糖和鲍鱼内脏多糖具有一定的抑菌特性;许翔等（2018）对可口革囊星蟲酶解液的抑菌性能进行了初步研究，但可口革囊星虫多糖提取物是否具有抑菌性能至今尚无定论。【本研究切入点】目前尚未见同时研究可口革囊星虫酶提多糖和滤渣碱提多糖工艺，并比较分析二者活性差异的文献报道。【拟解决的关键问题】以新鲜可口革囊星虫为试验材料，优化酶法—碱梯次提取工艺，并对比酶提和碱提两种多糖的抗氧化活性和抑菌性能，以期为可口革囊星虫酶解产物及不溶性虫体成分的梯次化加工利用提供研究基础，从而获得天然的抗氧化、抑菌多糖以应用于食品加工领域。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

新鲜可口革囊星虫购自钦州市东风市场（钦州市犀牛角镇捕获）。木瓜蛋白酶（100000 U/g）和碱性蛋白酶（50000 U/g）购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司;DPPH购自上海伊卡生物技术有限公司;葡萄糖标准品、无水乙醇、邻苯三酚、三（羟甲基）氨基甲烷、苯酚、硫酸、水杨酸、过氧化氢和硫酸亚铁均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC21600、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC10389、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10419和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC10275购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

主要仪器设备：ME204E电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、752紫外—可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]、SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、HH-4水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、V-100旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）和H1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 工艺流程 取新鲜可口革囊星虫清洗沥干水分后，匀浆至靡状，按照一定料液比稀释，加入复合酶50 ℃酶解一定时间，灭酶冷却至室温后，选择250 W超声波处理后过滤。取滤液经Sevage法沉淀蛋白，收集水层浓缩，加入4倍体积无水乙醇于4 ℃静置过夜，沉淀析出后干燥即为酶提多糖（Enzyma-tic extraction of polysaccharides，EEP）;取滤渣加入氢氧化钠溶液50 ℃处理一定时间，上清液经Sevage法沉淀蛋白，收集水层浓缩，经乙醇沉淀过夜，干燥沉淀即为碱提多糖（Alkali extraction of polysaccharides from filter residues，AEPR）。

1. 2. 2 多糖测定

1. 2. 2. 1 标准曲线绘制 准确称取经干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，加蒸馏水溶解，定容1000 mL，配制成质量浓度为0.1 g/mL的葡萄糖标准溶液。精确吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于25 mL比色管中，加蒸馏水至1.0 mL，再分别快速加入2 g/L的蒽酮—硫酸试剂4.0 mL，摇匀，室温放置10 min，于620 nm处测定吸光值。以蒸馏水作空白对照。以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，最小二乘法线性回归，得回归方程y=1.4986x-0.0051（R2=0.9953）。

1. 2. 2. 2 多糖提取率计算 按照标准曲线步骤利用蒽酮—硫酸法测定提取液中多糖，同时以相应含量酶溶液作空白。

多糖提取率（%）=C×V×10-3×n/m×100

式中，C为由回归方程计算所得多糖质量浓度（mg/mL）; V为可口革囊星虫多糖溶液体积（mL），n为可口革囊星虫多糖溶液稀释倍数，m为新鲜可口革囊星虫样品质量（g）。

1. 2. 3 单因素试验 基础工艺：经料液比1∶4（g/mL，下同）、3.0%复合蛋白酶（木瓜蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶2）50 ℃充分酶解4 h，1%氢氧化钠碱提1 h。

先以滤渣碱提多糖量为指标确定最适氢氧化钠浓度和碱提时间，再结合基础工艺依次改变料液比、酶添加量、酶解温度和酶解时间，分析单因素试验对酶提多糖和碱提多糖的影响。

1. 2. 4 正交试验 在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察指标，选取酶添加量（A），酶解温度（B）和酶解时间（C）3个因素进行L9（34）正交试验。试验因素与水平见表1。

1. 2. 5 可口革囊星虫多糖抗氧化性测定

1. 2. 5. 1 可口革囊星虫多糖溶液制备 按照正交试验优化条件提取可口革囊星虫酶解粗多糖和滤渣碱提粗多糖，获得酶解粗多糖中多糖含量为61%，水中溶解度（25 ℃）为35 g/100 g， 1%溶液（以测定多糖含量计）黏度为18±4 cp;滤渣碱提粗多糖中多糖含量为43%，水中溶解度（25 ℃）为41 g/100 g，1%溶液（以测定多糖含量计）黏度为27±2 cp。以粗多糖中多糖测定含量为依据，配置不同质量浓度多糖溶液备用。

1. 2. 5. 2 羟基自由基（·OH）清除率测定 参照Wang等（2013）、董兰芳等（2015）的方法，将干燥多糖按照1.2.5.1制成不同质量浓度多糖溶液，依次加入多糖溶液1.0 mL、8.0 mmol/L硫酸亚铁1.0 mL和8.0 mmol/L水杨酸—乙醇溶液1.0 mL，混匀后加入8.0 mmol/L过氧化氢1.0 mL摇匀，37 ℃水浴30 min，以蒸馏水作参比，于510 nm处测其吸光值。重复操作3次取平均值。以相同质量浓度Vc溶液作对照。

·OH清除率（%）=（A0-Af）/A0×100

式中，A0为试剂空白液吸光值，Af为多糖溶液吸光值，以未反应样品调零。

1. 2. 5. 3 DPPH自由基清除率测定 参照Alam等（2013）、孔帅（2014）的方法，分别取1.2.5.1制备的不同质量浓度样品溶液2.0 mL和0.04 g/L DPPH溶液2.0 mL置于不同试管中，混匀，室温下反应0.5 h，在517 nm处测定吸光值。以相同质量浓度Vc溶液作对照。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（As-Ar）/A0]×100

式中，As为样品组与2.0 mL DPPH的吸光值，A0为2.0 mL蒸馏水与2.0 mL DPPH的吸光值，Ar为2.0 mL待测样品与2.0 mL无水乙醇的吸光值。

1. 2. 6 多糖抗菌活性测定 取两种可口革囊星虫粗多糖，按照1.2.5.1用生理盐水配制成1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL多糖溶液备用。采用圆形纸片法（刘丽等，2016），分别将金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌活化培养24 h;刮取一接种环培养菌落置于10.0 mL生理盐水中（菌数106～107 CFU/mL），振荡摇匀得菌悬液，无菌操作吸取100 μL菌悬液至营养琼脂平板培养基表面，迅速用涂布棒均匀;取已消毒的圆形滤纸（直径6 mm）用移液枪缓慢注入多糖提取液20 μL，贴于培养基平板上并标记位置，以生理盐水作对照。37 ℃培养24 h后测量抑菌圈环直径（不含滤纸片直径）。每个样品设3个平行板，结果取平均值。

1. 3 统计分析

采用SPSS 17.0检验试验数据差异性，Excel 2010制图。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 氢氧化钠浓度对可口革囊星虫碱提多糖提取率的影响 在3.0%复合蛋白酶酶解条件下，酶提多糖平均提取率为0.620%，相对标准偏差（RSD）=0.027%（n=15）。0.5%～3.0%氢氧化钠浓度梯度碱提滤渣时，细胞质间与结构蛋白结合多糖在碱性作用下被释放出来，可口革囊星虫滤渣碱提多糖提取率呈先增后减的变化趋势，1.5%时提取率最高，为0.227%，显著高于其他碱浓度的多糖提取率（P<0.05，下同）（图1）。说明碱有利于滤渣中多糖提取，但碱浓度过高可能会破坏杂多糖结构，尤其是蛋白糖等，使得多糖提取率減小（刘玉明等，2011）。因此，最佳碱浓度为1.5%，此时可口革囊星虫总多糖提取率为0.847%。

2. 1. 2 碱提时间对可口革囊星虫碱提多糖提取率的影响 由图2可知，在0.5～5.0 h范围内，可口革囊星虫滤渣碱提多糖提取率先增大后减小，碱提时间为2.0 h时，提取率达最大值（0.237%），显著高于0.5、1.0和5.0 3个碱提时间的多糖提取率。说明在一定时间内碱溶液有助于多糖提取，但碱提时间过长，提取率直线下降，可能是碱溶液对多糖产生了降解作用（薛芳等，2008;Ballesteros et al.，2015）。因此，最佳碱提时间为2.0 h。此外，酶提多糖提取率为0.650%，可口革囊星虫总多糖提取率为0.887%。

2. 1. 3 料液比对可口革囊星虫多糖提取率的影响 从图3可看出，料液比在1∶3～1∶7范围内时，可口革囊星虫酶提多糖提取率随料液比的减小而呈先增后减的变化趋势，料液比为1∶5的提取率最高（0.823%），可能是此时能最大限度增加底物与蛋白酶接触，且已达水溶多糖扩散速率大于溶出速率的要求，而继续增加溶液体积不仅对多糖总溶出量无贡献，反而促使其他物质溶出，不利于多糖醇沉分离。对滤渣碱提多糖，其提取率随料液比的减小逐渐下降，至料液比1∶5后趋于平稳。因此，最佳料液比为1∶5，此时的滤渣碱提多糖提取率为0.117%，可口革囊星虫总多糖提取率为0.940%。

2. 1. 4 酶添加量对可口革囊星虫多糖提取率的影响 从图4可看出，复合蛋白酶添加量在1.0%～5.0%范围内，可口革囊星虫酶提多糖提取率先增大后趋于平稳。复合蛋白酶添加量为3.0%时，提取率达最大值（0.827%），之后保持稳定，表明蛋白酶对结构蛋白的解离有助于多糖溶出，且3.0%酶用量基本达到可接触底物饱和浓度（Zhang et al.，2011）。滤渣碱提多糖提取率随酶用量的增加呈递减趋势，但酶添加量达3.0%后又缓慢回升。考虑到过量的蛋白酶会增加其他干扰性杂质溶出，以及尽可能增加滤渣碱提多糖得率，选择4.0%为适宜酶添加量。此时，滤渣碱提多糖提取率为0.133%，可口革囊星虫总多糖提取率为0.960%。

2. 1. 5 酶解温度对可口革囊星虫多糖提取率的影响 从图5可看出，酶解温度对可口革囊星虫酶提多糖提取率的影响有明显峰值，60 ℃时达最大值（1.050%）。在60 ℃以下，酶提多糖提取率几乎呈直线上升，表明复合蛋白酶对可口革囊星虫组织多糖的释放受温度影响显著，温度过低，酶不能充分发挥其作用;温度过高则酶失活（苏伟等，2017）。结合图4酶添加量的影响来看，滤渣碱提多糖在低酶解度时并未获得高提取率，说明蛋白酶解对于可口革囊星虫多糖提取率的影响远大于碱液作用。因此，最佳酶解温度为60 ℃，此时滤渣碱提多糖提取率为0.169%，可口革囊星虫总多糖提取率为1.219%。

2. 1. 6 酶解时间对可口革囊星虫多糖提取率的影响 由图6可知，随酶解时间的延长，可口革囊星虫酶解多糖提取率呈先增后减的变化趋势，酶解4 h时达最大值（1.059%）。酶解时间过长，糖苷键在蛋白酶的催化作用下会被裂解（苏伟等，2017），同时会增加溶解蛋白、分子肽等含量，通过Sevage法脱出蛋白时需要的分离次数明显增加，多糖损失随之增加，故酶解时间超过4 h后酶提多糖提取率开始下降。酶解4 h后滤渣碱提多糖的提取率也达最大值（0.203%），因此最佳酶解时间为4 h，可口革囊星虫总多糖提取率为1.262%。

2. 2 正交试验结果

从正交试验结果（表2）可看出，酶提多糖提取率最优组合为A2B1C2，滤渣碱提多糖提取率最优组合为A3B1C2。酶添加量（A）是影响滤渣碱提多糖提取率的主要因素，且对于酶提多糖在2水平和3水平具有相近的提取率，故选取A3B1C2作为两种多糖提取酶解的最优组合，即可口革囊星虫多糖酶法—碱梯次提取的最佳工艺条件为酶添加量4.0%、酶解温度55 ℃、酶解时间4 h、料液比1∶5、滤渣碱提时间2.0 h、氢氧化钠浓度1.5%。

采用最佳条件进行提取，经试验验证，酶解多糖提取率为1.076%，滤渣碱提多糖提取率为0.171%，总多糖提取率为1.247%（RSD=0.025%，n=5）。

由表3可知，在正交试验所选水平上对酶提多糖提取率影响显著的仅有酶解时间（P<0.1），而酶添加量和酶解温度的影响无显著影响（P>0.1），说明这两个因素的提取工艺参数比较稳定;而对滤渣碱提多糖提取率影响显著的是酶解时间和酶添加量（P<0.05），说明滤渣碱提多糖的提取率受酶解工艺条件影响较大。

2. 3 多糖抗氧化活性测定结果

2. 3. 1 对·OH的清除效果 由图7可知，在1.0～5.0 mg/mL的样品质量浓度范围内，可口革囊星虫酶提多糖和滤渣碱提多糖对·OH的清除能力均随质量浓度的增大而增强，具有一定的量效关系;酶提多糖清除·OH的半抑制浓度（IC50）为2.6 mg/mL，在5.0 mg/mL时的清除率达84.10%，而滤渣碱提多糖表现出较平缓的浓度效应关系，IC50为4.9 mg/mL，其对·OH的清除能力弱于酶提多糖。

2. 3. 2 对DPPH自由基的清除效果 由图8可知，可口革囊星虫酶提多糖和滤渣碱提多糖在一定质量浓度范围内对DPPH自由基具有清除作用，且随质量浓度增加，其清除效果逐渐增强。酶提多糖在5.0 mg/mL时的清除率为50.10%，IC50为4.4 mg/mL;而滤渣碱提多糖对DPPH自由基清除作用与酶提多糖无明显差异，对应的IC50为5.1 mg/mL。

2. 4 多糖抑菌活性测定结果

从表4可看出，可口革囊星虫酶提多糖和碱提多糖在1.560 mg/mL浓度以上对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用。酶提多糖对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈明显大于大肠埃希氏菌和銅绿假单胞菌;而碱提多糖在同等抑菌浓度下，表现出更明显的抑菌效果，尤其是对大肠埃希氏菌的抑制能力明显强于酶提多糖。两种多糖均为粗多糖，可能存在糖蛋白或糖肽等，故其抑菌机制是多种途径共存。

3 讨论

本研究采用梯次化开发应用的提取思路，综合考虑酶提多糖和滤渣碱提多糖提取率，发现蛋白酶酶解可口革囊星虫可有效释放其虫体组织结构水溶性多糖，同时酶解程度与滤渣碱提多糖提取率同样有着较显著的影响关系，且这种影响主要集中在酶解时间和酶添加量两个因素。目前已有的可口革囊星虫多糖研究主要集中于体腔液多糖和虫体水溶性多糖的提取和功能性研究（李妍妍等，2007;梁倩蓉等，2015），忽略了虫体水提滤渣中多糖的研究。本研究优化得出最佳方案的总多糖提取率达1.247%，比孔帅等（2014）获得的提取率（0.879%）提高了41.9%，除了增加滤渣碱提多糖之外，其原因可能是碱性蛋白酶比胰蛋白酶更适用于虫体蛋白的酶解;此外，本研究采用超声处理也是多糖提取率增加的一个原因。梯次化开发是综合利用最大化的有效手段，目前可口革囊星虫研究基本围绕酶解工艺展开，梯次化提取可综合考虑酶解溶出多糖、酶解肽和酶解滤渣的利用等，既能最大限度地提高功能多糖提取率，又可以得到酶解肽溶液。在工艺实施中只需调整蛋白沉降和多糖醇沉的工艺顺序即可有目的地获得不同纯度酶解肽和多糖产品，在可口革囊星虫高值化开发利用方面具有广阔的应用前景。

本研究对梯次化提取两种多糖的抗氧化性和抑菌性能进行系统比较，发现两种多糖均具有抗氧化和抑菌活性，且滤渣碱提多糖表现出更强的抑菌性能。根据抑菌物和菌体细胞壁结合方式，多糖抑菌的方式有两种：一是大分子多糖与细胞壁结合形成表面膜阻碍菌体营养吸收，或结合态多糖干扰菌体外质膜从而破坏菌体正常代谢（张雅利等，2008）;二是小分子与小分子成分进入菌体细胞内，引起絮凝，从而影响生理因子功效，达到抑菌效果（No et al.，2002）。两种多糖抑菌性能产生差异的原因可能是可口革囊星虫酶解后，结构多糖被释放出来，主要在细胞壁结构较厚的革兰氏阳性菌表面形成表面膜，对其生理代谢产生阻隔作用;而滤渣碱提多糖由于碱液作用对部分多糖及结合态多糖具有降解作用，会形成相对较小分子的多糖及其他活性成分，从而可以进入革兰氏阴性菌内部干扰菌体的生理活性，增强抑菌效果。本研究结果不仅为可口革囊星虫多糖综合利用提供了参考，还为可口革囊星虫虫体在抑菌性能方面的研究提供了新思路。

本研究因未对提取的多糖进行纯化，故未进行最低抑菌浓度（MIC）分析，但从粗多糖的自由基清除能力和抑菌性能来看，在其复合食品加工利用中可有效减少抑菌剂和抗氧化剂的添加。但对于滤渣碱提多糖与酶提多糖的单糖组成间是否存在差异仍有待进一步研究;此外，可口革囊星虫多糖与酶解肽的协同抑菌机制也是一个值得研究的课题。

4 结论

采用优化的酶法—碱梯次提取工艺可从可口革囊星虫酶解液和滤渣中有效提取多糖，且两种多糖均具有较强的抗氧化活性和抑菌作用，对可口革囊星虫酶解后的加工处理工艺有较高的参考价值。

参考文献：

丁侃. 2018. 中药多糖结构与功能及其机制[M]. 北京：科学出版社. [Ding K. 2018. Structure，Function and Mechanism of Chinese Medicine Polysaccharides[M]. Beijing：Science Press.]

董兰芳，张琴，童潼，许明珠. 2013. 方格星虫多糖抗菌和抗氧化活性研究[J]. 广西科学，20（4）：289-293. [Dong L F，Zhang Q，Tong T，Xu M Z. 2013. Studies on the antimicrobial and antioxidant activities of polysaccharide from Sipunculus nudus[J]. Guangxi Sciences，20（4）：289-293.]

董兰芳，张琴，童潼，许明珠. 2015. 方格星虫体腔液多糖的提取及体外抗氧化活性[J]. 食品研究与开发，36（11）：46-49. [Dong L F，Zhang Q，Tong T，Xu M Z. 2015. Extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Sipunculus nudus coelomic fluid[J]. Food Research and Development，36（11）：46-49.]

黄岛平，刘永强，林葵，黄文琦，陈秋虹，陈建红，黄艳. 2012. 北部湾革囊星虫和方格星虫主要营养成分比较分析[J]. 大众科技，14（8）：172-173. [Huang D P，Liu Y Q，Lin K，Huang W Q，Chen Q H，Chen J H，Huang Y. 2012. Comparative analysis of main nutritive components on Phascolosoma esulenta and Sipunculus nudus in Beibu Gulf[J]. Popular Science & Technology，14（8）：172-173.]

孔帥. 2014. 可口革囊星虫多糖对小鼠免疫调节作用的研究[D]. 宁波：宁波大学. [Kong S. 2014. Immunomodulatory effects of polysaccharides from Phascolosoma esulenta on mice[D]. Ningbo：Ningbo University.]

孔帅，刘连亮，陆新江，史雨红，陈炯. 2014. 响应面法优化可口革囊星虫抗氧化多糖提取工艺研究[J]. 食品工业科技，35（11）：233-237. [Kong S，Liu L L，Lu X J，Shi Y H，Chen J. 2014. Optimization of extraction process by response surface methodology of anti-oxidant polysaccharides from Phasolosma esculenta[J]. Science and Technology of Food Industry，35（11）：233-237.]

李凤鲁. 1989. 中国沿海革囊星虫属（星虫动物门）的研究[J]. 青岛海洋大学学报，19（3）：78-90. [Li F L. 1989. Studies on the genus Phascolosoma（Sipuncula） of the China coasts[J]. Journal of Ocean University of Qing-dao，19（3）：78-90.]

李妍妍，徐巧云，郑卫星，丁理发，陈才利，苏秀榕. 2007. 可口革囊星虫体腔液多糖的研究[C]//中国药学会. 2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集：527-528. [Li Y Y，Xu Q Y，Zheng W X，Ding L F，Chen C L，Su X R. 2007. Studies on polysaccharides from Phasolosma esculenta coelomic fluid[C]//Chinese Pharmaceutical Associa-tion. Papers Collection of 2007 National Annual Conferen-ce on Biochemical and Biotechnical Pharmaceuticals：527-528.]

李永强. 2011. 北部湾（广西段）潮间带大型底栖动物的调查研究[D]. 青岛：青岛理工大学. [Li Y Q. 2011. The macrozoobenthos of intertidal zone in Beibu Gulf（Guangxi）[D]. Qingdao：Qingdao University of Technology.]

梁倩蓉，于曙光，刘顺，王国良，郑晓叶，彭雪美惠，周素明. 2015. 可口革囊星虫Phasolosma esculenta体腔液的抗菌活性研究[J]. 海洋学研究，33（2）：70-75. [Liang Q R，Yu S G，Liu S，Wang G L，Zheng X Y，Peng X M H，Zhou S M. 2015. Antibacterial activity of the coelomic fluid from a marine worm，Phasolosma esculenta[J]. Journal of Marine Sciences，33（2）：70-75.]

刘丽，徐春，李可，姜昆，吴鹏. 2016. 九资河茯苓多糖的超声波提取工艺及抑菌性研究（英文）[J]. 农业科学与技术，17（12）：2746-2750. [Liu L，Xu C，Li K，Jiang K，Wu P. 2016. Optimal ultrasonic extraction of pachyman from Jiu-zihe Poria cocos[J]. Agricultural Science & Technology，17（12）：2746-2750.]

刘玉明，钱甜甜，何颖，蒋定文，沈先荣，江叔奇，杨进刚. 2011. 方格星虫多糖不同提取工艺的比较研究[J]. 时珍国医国药，22（6）：1454-1455. [Liu Y M，Qian T T，He Y，Jiang D W，Shen X R，Jiang S Q，Yang J G. 2011. Comparative study on polysaccharide from Sipunculus nudus by different extraction process[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，22（6）：1454-1455.]

莫新. 2017. 可口革囊星虫高密度养殖技术[J]. 科学养鱼，（1）：47. [Mo X. 2017. High density breeding technology of the Phscolosoma esculenta[J]. Scientific Fish Farming，（1）：47.]

牛荣丽，唐健红. 2012. 可口革囊星虫抗疲劳作用的研究[J]. 食品工业科技，33（24）：389-391. [Niu R L，Tang J H. 2012. Research of anti-fatigue effect of Phascolosoma esculenta[J]. Science and Technology of Food Industry，33（24）：389-391.]

苏伟，宋玉，母应春，李泽秀，黎以栾. 2017. 响应面法优化木瓜蛋白酶提取红稗多糖工艺[J]. 食品工业科技，38（7）：256-261. [Su W，Song Y，Mu Y C，Li Z X，Li Y L. 2017. Optimization of extraction of polysaccharides from Baccage sedge using papain by response surface metho-dology[J]. Science and Technology of Food Industry，38（7）：256-261.]

田振華，李永斌，李颖，楚华航，郝丽丽，宿婷婷，张莉 . 2013. 牡蛎多糖制备工艺优化及体外抑菌活性的探讨[J]. 食品研究与开发，34（17）：23-26. [Tian Z H，Li Y B，Li Y，Chu H H，Hao L L，Su T T，Zhang L. 2013. Optimization of preparation technology and antimicrobial activity of polysaccharide extracts from Rushan Bay oyster（Crassos-trea gigas） in China[J]. Food Research and Development，34（17）：23-26.]

王冲. 2005. 蚯蚓（Eisenia fetida）生态免疫系统研究Ⅰ——体壁屏障系统及协同防御机理[D]. 北京：中国农业大学. [Wang C. 2005. Research of ecology immunity system in the Eisenia fetidaⅠ—Antibiotic barrier system and mecha-nism of joint prevention[D]. Beijing：Ocean University of China.]

王芳芳. 2013. 盐碱地生态养殖可口革囊星虫试验[J]. 科学养鱼，（5）：73-74. [Wang F F. 2013. A study on the ecological culture of the Phscolosoma esculenta in saline-alkali soil[J]. Scientific Fish Farming，（5）：73-74.]

王帅. 2018. 北部湾革囊星虫属资源初探及遗传多样性分析[D]. 南宁：广西大学. [Wang S. 2018. The preliminary study on the resources of Phascolosoma in Beibu Gulf and its genetic diversity[D]. Nanning：Guangxi University.]

吴雅清，姜宏瑛，刘接卿，马国兴，刘嘉，许瑞安. 2015. 星虫动物的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国海洋药物，34（5）：86-92. [Wu Y Q，Jiang H Y，Liu J Q，Ma G X，Liu J，Xu R A. 2015. Advances of chemical components and pharmacological properties of Sipuncula[J]. Chinese Journal of Marine Drugs，34（5）：86-92.]

徐敏娴，丁理法，周敏华. 2011. 可口革囊星虫人工繁育及增养殖技术的研究[J]. 中国水产，（11）：39-41. [Xu M X，Ding L F，Zhou M H. 2011. Studies on artificial propagation and breeding techniques of the Phscolosoma esculenta[J]. China Fisheries，（11）：39-41.]

许翔，蔡怀依，袁爽，李勇勇，娄永江，宁梦华. 2018. 酶解法制备可口革囊星虫抗菌物质的研究[J]. 中国抗生素杂志，43（4）：471-475. [Xu X，Cai H Y，Yuan S，Li Y Y，Lou Y J，Ning M H. 2018. Research on enzymatic hydrolysis production of the antibacterial substances from Phasolosma esculenta[J]. Chinese Journal of Antibiotics，43（4）：471-475.]

薛芳，颜瑞，王承明. 2008. 超声辅助碱提取花生多糖的研究[J]. 食品科学，29（8）：158-163. [Xue F，Yan R，Wang C M. 2008. Study on ultrasonic assisted alkali extraction of peanut polysaccharides[J]. Food Science，29（8）：158-163.]

张瑞娟，柯莉娜，郑静，石艳，王勤. 2018. 鲍鱼内脏多糖的提取、纯化及其抗氧化和抑菌活性[J]. 厦门大学学报（自然科学版），57（1）：58-64. [Zhang R J，Ke L N，Zheng J，Shi Y，Wang Q. 2018. Extraction，purification and antioxidant and antibacterial activity analysis of polysaccharides from abalone viscera[J]. Journal of Xiamen University（Natural Science），57（1）：58-64.]

张雅利，梁花香，曹娜. 2008. 提取方法对柿多糖提取率及生物活性的影响[J]. 食品与生物技术学报，27（6）：18-22. [Zhang Y L，Liang H X，Cao N. 2008. Effect of extraction method on yield and bioactivities of polysaccharide from persimmon fruit[J]. Journal of Food Science and Biotechnology，27（6）：18-22.]

Alam M N，Bristi N J，Rafiquzzaman M. 2013. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity[J]. Saudi Pharmaceutical Journal，21（2）：143-152.

Ballesteros L F，Cerqueira M A，Teixeira J A，Mussatto S I. 2015. Characterization of polysaccharides extracted from spent coffee grounds by alkali pretreatment[J]. Carbohydrate Polymers，127：347-354.

No H K，Park N Y，Lee S H，Meyers S P. 2002. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with diffe-rent molecular weights[J]. International Journal of Food Microbiology，74（1-2）：65-72.

Wang S P，Dong X F，Tong J M. 2013. Optimization of enzyme-assisted extraction of polysaccharides from alfalfa and its antioxidant activity[J]. International Journal of Bio-logical Macromolecules，62（11）：387-396.

Zhang J，Jia S Y，Liu Y，Wu S H，Ran J Y. 2011. Optimization of enzyme-assisted extraction of the Lycium barbarum polysaccharides using response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers，86（2）：1089-1092.

（責任编辑 罗 丽）