4株禽腺病毒的鉴定和分析

胡晓苗 潘孝成 张丹俊 赵瑞宏 戴银 潘孝成 侯宏艳 沈学怀 尹磊

摘要 [目的]对六安、郭河、宣城、肥西某养殖户送检的疑似腺病毒的病料进行分离鉴定，为进一步鉴别、预防和控制疾病提供科学的理论依据。[方法]首先采集病例中鸡的肝脏，提取病毒DNA，根据Genbank已登录腺病毒的hexon基因设计引物，通过PCR检测病料中腺病毒，对扩增的序列进行连接转化和阳性克隆子筛选，并对扩增到的序列进行测序鉴定，最后将获得的基因序列构建进化树分析确定安徽省部分地区禽腺病毒血清型。[结果]临床中疑似腺病毒感染的主要症状为心包积液和肝脏肿大，用设计的引物均检测出大小为599 bp的目的基因條带，序列比对结果发现，此次检测的腺病毒均为4型腺病毒。[结论]试验建立了快速检测禽腺病毒的方法，为安徽省地区禽腺病毒防控提供了理论依据。

关键词 禽腺病毒;hexon;测序;血清型鉴定

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2019）06-018-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.008

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）属于腺病毒科禽腺病毒属，主要寄生于禽类的眼、上呼吸道、肝、肾、生殖道和消化道内，但以隐性或不显性感染为主，一旦机体受到应激反应或其他疾病感染时，病毒就会很快发生反应而产生致病性，同時也可以作为原发性病原引起其他疾病的继发感染。禽腺病毒有A～E 5个亚群，根据交叉中和试验分为12个血清型，为FAV1～FAV12。查阅相关资料发现，12种血清型在致病性上都有各自的特征，而且同一血清型中的不同毒株也会有不同的致病性表现。Ⅰ群禽腺病毒的毒粒共有250个颗粒，其中结构蛋白六邻体（hexon）含有240个壳粒，由此可见hexon占了90%以上，因而依据编码该基因蛋白建立的PCR分子诊断方法可更准确地对该群血清型进行鉴定。病毒的传播扩散主要经过鸡胚进行垂直传播，同时也经过水平传播扩散，该病毒扩散能力较强，潜伏期短，发病快，正常鸡接触后极易发生感染。

2019年3—5月，笔者于安徽省农业科学院畜牧兽医研究所收集了4份疑似禽腺病毒感染家禽的肝脏作为病毒分离材料，根据Genbank已登录腺病毒的hexon基因设计引物，寻找最佳的PCR反应体系检测病料中腺病毒的有无，对扩增的序列进行连接转化和阳性克隆子筛选并把扩增到的序列送至生物公司进行测序鉴定，最后将获得的基因序列构建进化树确定安徽省部分地区禽腺病毒血清型。经检测4份病料均为阳性病料，与血清4型同源性最高，这为准确和快速对禽腺病毒进行检测奠定了基础。该试验通过对疑似FAV病料的鉴定及测序分析，进一步了解到Ⅰ群禽腺病毒的感染流行病学特点，为其防治提供了科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

4份病料分别来源于六安某养殖户送检的18日龄土鸡、郭河某养殖户送检的40日龄土鸡、宣城某养殖户送检的20日龄白羽肉鸡和肥西某养殖户送检的2月龄土鸡。

1.2 临床病理检查

鸡群感染后通常表现为食欲减退、萎靡不振、羽毛蓬乱，发病前无明显的特殊行为表现，通常发病快、死亡快。禽腺病毒C种血清4型感染的病例临床剖检可见心包有淡黄色积液，肝脏肿大、颜色变淡有炎症、表面有出血点等病理变化。

1.3 病毒hexon基因的PCR扩增和鉴定

1.3.1 病毒基因组DNA的提取 病毒DNA的提取参照提取试剂盒说明书操作。

1.3.2 病毒引物的设计与合成 根据Genbank公司已登录的禽腺病毒序列设计此次试验引物基因hexon的序列（5’3’）：上游引物为CCAAGATGGCGCACGCAACTACAA，下游引物为AGCGCGAAAGGCGTACGGAAG，预期PCR反应体系扩增的片段长度为599 bp。用设计的引物寻找PCR扩增最佳反应体系和程序，然后对4份分离的毒株进行PCR检测。

1.3.3 基因的PCR扩增 以提取的DNA作为模板，进行目的基因的扩增。PCR反应体系为25 μl：Taq mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，灭菌蒸馏水补至25 μl，在无菌超净台中将上述液体加到0.5 ml EP管中，EP管事先经过高压锅消毒灭菌。PCR反应程序为：95℃预变性5 min;94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环;最后72℃延伸10 min。

1.3.4 扩增基因与T载体的连接转化PCR扩增获得的目的条带片段进行回收，参照琼脂糖DNA回收试剂盒进行回收，然后进行T载体连接与转化。①将回收的DNA片段与pMD18T Vector连接，连接体系如下：T载体（pMD18T Vector）0.5 μl，目的基因（hexon）4.5 μl，Solution Ⅰ 5.0 μl。将连接好的体系置于16℃水浴30 min。②转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，用摇后的菌液进行PCR反应，反应体系如上所示。最后将能成功PCR检测出扩增目的基因的菌液送去测序。测序工作由南京擎科生物技术有限公司进行。

1.3.5 阳性克隆子的筛选和序列测定 PCR扩增到目的条带的凝胶进行回收，然后进行T载体连接与转化后，挑选出抗性板上长出的菌落制成菌液，然后对PCR鉴定的阳性菌液进行测序，对检测得到的序列测定结果进行拼接，经过DNAstar软件绘制出序列峰图，观察其各个主峰以及突变的位点，判断其突变率是否在正常范围内波动。对扩增得到的hexon基因部分序列，经DNAstar软件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列经NCBI在线BLAST进行同源性比对分析。

1.4 扩增序列的血清型鉴定

运用DNAstar软件系统将序列与各群hexon序列进行同源性分析，根据相关参考文献，比较hexon序列峰图和同源性比对图。然后根据生物公司检测的序列结果经MegAlign软件绘制出遗传系统的进化树，分析判断4份毒株的血清型。

2 结果与分析

2.1 临床病理的主要病理学变化

对4位养殖户的陈述进行记录，病畜均有采食量减少、萎靡不振、蹲伏等表现，以及不同程度的死亡现象。对病死鸡进行整体观察，发现有羽毛蓬乱、面部苍白、营养不良等表现。经剖检观察，可见心包有淡黄色的积液，肝脏肿大、有出血点（图1）。

2.2 目的基因的扩增

对提取出的4份病料的DNA用设计的hexon引物进行PCR扩增，然后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，对成功PCR电泳跑出目的条带的凝胶进行回收，在T载体连接并转化DH5α转感受态细胞步骤后，挑选出抗性板上长出的单个菌落制成菌液，然后对得到的菌液进行PCR鉴定。由图2可见，扩增得到599 bp左右的片段，与预期大小相符。

2.3 阳性克隆子的筛选

对成功PCR电泳的目的条带的凝胶进行回收，将成功完成阳性克隆的基因送至生物公司测序，对检测得到的序列图经过DNAstar软件绘制出序列峰图（图3），可以观察到各个主峰以及其突变的位点，查阅相关文献后经比对其突变率均在正常范围内波动。

对扩增得到的hexon基因部分序列，经DNAstar软件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列经NCBI在线BLAST分析并经同源性比對，结果显示，4个病毒分离株的基因序列均与GenBank数据库中的FAV最为相近。分离株的hexon基因序列与血清4型FAV分离株NIVD2、SDSX1、SDTW/SD/TA/2015、HLJDAd15、SDTW116的同源性为99%（图4）。

2.4 病毒hexon基因的进化树分析

根据生物公司检测的序列结果经MegAlign软件绘制出遗传系统的进化树。由图5可见，该试验分离的4份病料的毒株与Ⅰ群腺病毒属于同一分支，与血清4型的禽腺病毒亲缘关系更近，核苷酸序列同源性为100%。

3 讨论

3.1 hexon可以作为鉴定腺病毒的重要基因

临床诊断是诊断动物疫病最基本的方法，除了临床诊断方法，也可用分子检测对疾病进一步确诊。腺病毒的毒粒共有252个壳粒，其中240个六邻体，12个五邻体，五邻体分布在每个角上，由此可见六邻体蛋白（hexon）占据了病毒结构的大部分。Hexon基因具有Ⅰ群禽腺病毒特异性抗原的决定簇，含有与细胞受体结合的位点，可看作病毒的一种保护基因，用hexon基因作扩增的引物可区分出A～E和不同的血清型，因此该试验选取hexon基因进行克隆与序列分析，经鉴定4份病料的分离株均与Ⅰ群禽腺病毒C种血清4型的同源性最高，亲缘关系最近。

3.2 Ⅰ群禽腺病毒的现状及防控

通过此次试验对FAVⅠ病料的分离鉴定分析和阅读相关文献后，了解到该病在鸡群中的发病率近年来呈增长趋势，且病毒扩散能力较强，感染宿主的范围也在逐渐扩大，土鸡、白羽肉鸡、蛋鸡、鹅、番鸭、麻鸭均出现对该病的感染病例。在大多数成年鸡的体内发现了腺病毒抗体的存在，由此可见禽腺病毒以隐性感染为主。因此在饲养过程中做好生物安全防控措施至关重要，同时做好常规疫苗免疫措施，提高饲料的营养水平，增强鸡的免疫力，对于已出现感染病例的养殖场，应做好相关隔离工作，控制疫病的大面积扩散。

经过查阅相关报道和临床观察发现，在各地养禽产业出现的腺病毒感染病例主要表现为血清4型引起的心包积液综合征、血清8型引起的包涵体肝炎和血清1型引起的砂囊糜烂。在12个血清型中其中1型病毒的纤突上有血凝素，剩下的血清型无此特性，在临床病例的检查中发现同一病例中可能存在2种以上的血清型病毒。同一个血清型中的不同毒株也会对动物体产生不同的致病性，因此了解不同血清型的结构及典型致病特点对该病的诊断防控有重要意义。

参考文献

[1] 李晓林，王相芹，罗济冠，等.Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其致病性研究[J].中国动物检疫， 2016，33（8）：86-89.

[2] 罗思思，谢芝勋，邓显文，等.Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析[J].畜牧与兽医，2012，44（1）：52-56.

[3] 罗洋洋，招丽婵，李群辉，等.Ⅰ群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性[J].华南农业大学学报，2017，38（6）：27-33.

[4] JOUBERT H W，AITCHISON H，MAARTENS L H， et al. Molecular differentiation and pathogenicity of aviadenoviruses isolated during an outbreak of inclusion body hepatitis in South Africa[J]. Journal of the South African Veterinary Association，2014， 85（1）： 1058.

[5] NIU Y J，SUN W，ZHANG G H， et al. Hydropericardium syndrome outbreak caused by fowl adenovirus serotype 4 in China in 2015[J]. Journal of General Virology， 2016， 97（10）： 2684-2690.

[6] 初欢欢，单虎，郑秀云，等.9株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及hexon基因的遗传变异分析[J].中国兽医杂志.2017，53（1）：1-9.

[7] 墨海峡，陈雪姣，周鹏，等.蛋鸡Ⅰ群腺病毒湖北株的分离与分子鉴定[J].中国动物传染病学报.2018，26（2）：28-33.

[8] 杨作丰.禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法[J].湖北畜牧兽医，2017，38（2）：5-7.

[9] LI Y，FU J，CHANG S， et al.Isolution， identification， and hexon gene characterization of fowl adenoviruses from a contaminated live Newcastle disease virus vaccine[J].Poultry Science，2017，96（5）：1094-1099. doi：10.3382/ps/pew405.

[10] 王娟，刘亮亮，李慧昕，等.禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析[J].中国兽医科学，2017，47（6）：755-761.

[11] HESS M. Detection and differentiation of avian adenviruses：a review[J]. Avian Pathology，2000，29（3）：195-206.

[12] 申祖杰，黎世彬，林华源，等.禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及致病性研究[J].中国兽医科学，2018，48（6）：722-728.

[13] 李京帅，李银聚，张春杰，等.禽腺病毒血清4型河南株的分离鉴定及对鸡胚致病性的研究[J].中国兽医科学，2018，48（4）：479-483.

[14] 王小辉.Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[D].江苏：扬州大学，2008.

[15] 杨振，董昌海，李甜甜，等.四株Ⅰ群禽腺病毒的分离与鉴定[J].中国家禽.2017，39（19）：73-76.

责任编辑：郑丹丹