HPLC法同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量

韩真真 邵长森 张元元 王绍花 刘莉 林桂涛 盛华刚

摘 要 目的：建立同时测定桂枝加芍药汤中芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm（0～35 min，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷）、280 nm（35～65 min，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚），柱温为25 ℃，进样量为20 μL。结果：芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚检测质量浓度线性范围分别为2.125～34.000 μg/mL（r=0.999 9）、28.700～459.200 μg/mL（r=0.999 7）、3.675～58.800 μg/mL（r=0.999 7）、1.235～19.760 μg/mL（r=0.999 8）、2.300～36.800 μg/mL（r=0.999 8）、0.955～15.280 μg/mL（r=0.999 7）、36.000～576.000 μg/mL（r=0.999 7）、1.500～24.000 μg/mL（r=0.999 7）；定量限分別为0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL，检测限分别为0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%（n=6）；加样回收率分别为97.47%～100.76%（RSD=1.33%，n=6）、98.15%～103.50%（RSD=1.82%，n=6）、95.65%～100.84%（RSD=2.38%，n=6）、96.75%～100.32%（RSD=1.31%，n=6）、95.88%～102.75%（RSD=2.52%，n=6）、95.63%～100.63%（RSD=2.00%，n=6）、96.78%～100.45%（RSD=1.35%，n=6）、95.71%～100.48%（RSD=1.80%，n=6）。结论：该方法准确、可靠，专属性好，可用于同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量。

关键词 桂枝加芍药汤；高效液相色谱法；含量测定；芍药内酯苷；芍药苷；甘草苷；甘草素；肉桂酸；桂皮醛；甘草酸铵；6-姜酚

Simultaneous Determination of 8 Ingredients in Guizhijiashaoyao Decoction by HPLC

HAN Zhenzhen，SHAO Changsen，ZHANG Yuanyuan，WANG Shaohua，LIU Li， LIN Guitao，SHENG Huagang（College of Pharmacy， Shandong University of TCM， Jinan 250355， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of albiflorin， paeoniflorin， liquiritin， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol in Guizhijiashaoyao decoction. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 235 nm（0-35 min，albiflorin， paeoniflorin， liquiritin）、280 nm（35-65 min，liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol）. The column temperature was 25 ℃， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of albiflorin， paeoniflorin， liquiritin， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol were 2.125-34.000 μg/mL（r=0.999 9）， 28.700-459.200 μg/mL（r=0.999 7）， 3.675-58.800 μg/mL（r=0.999 7）， 1.235-19.760 μg/mL（r=0.999 8）， 2.300-36.800 μg/mL（r=0.999 8）， 0.955-15.280 μg/mL（r=0.999 7）， 36.000-576.000 μg/mL（r=0.999 7） and 1.500-24.000 μg/mL（r=0.999 7）， respectively. The quantitative limits were 0.135， 0.102， 0.096， 0.033， 0.013， 0.023， 0.663， 0.198 μg/mL； the detection limits were 0.041， 0.031， 0.029， 0.010， 0.004， 0.007， 0.201， 0.059 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3% （n=6）. The recovery rates were 97.47%-100.76%（RSD=1.33%，n=6）， 98.15%-103.50%（RSD=1.82%，n=6）， 95.65%-100.84%（RSD=2.38%，n=6）， 96.75%-100.32%（RSD=1.31%，n=6）， 95.88%-102.75%（RSD=2.52%，n=6）， 95.63%-100.63%（RSD=2.00%，n=6）， 96.78%-100.45%（RSD=1.35%，n=6）， 95.71%-100.48%（RSD=1.80%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable and exclusive， and suitable for simultaneous determination of 8 ingredients in Guizhijiashaoyao decoction.

KEYWORDS Guizhijiashaoyao decoction； HPLC； Content determination； Albiflorin； Paeoniflorin； Liquiritin； Liquiritigenin； Cinnamic acid； Cinnamaldehyde； Ammonium glycyrrhetate； 6-ginger phenol

桂枝加芍药汤出自《伤寒论》：“本太阳病，医反下之，因尔腹满时痛者，属太阴也”。桂枝加芍药汤由桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大枣等5味中药组成，具有调和营卫、理脾和中、缓急止痛的功效[1]，临床常用于治疗月经痛、胃痛、腹痛、胃肠痉挛、慢性痢疾等症[2-5]。有研究发现，桂枝汤中的桂皮醛、肉桂酸、芍药苷、甘草酸等均具有抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛的作用[6-7]。桂皮醛是桂枝中主要的挥发油成分，具有镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用；肉桂酸是桂枝中主要的有機酸类成分，具有杀菌、止血、抗肿瘤等作用[8]。芍药苷为赤芍的主要成分，芍药内酯苷为芍药苷的同分异构体，均具有镇痛、镇静、解痉及免疫调节的作用[9]。炙甘草中的甘草苷可用于治疗咽炎、急、慢性咳嗽，具有抗抑郁、神经保护等作用； 甘草素是炙甘草中含量较高的黄酮类成分之一，为甘草苷的苷元，具有保肝的作用；甘草酸是炙甘草的主要成分，可在体内转化为甘草次酸，进而发挥抗炎、抗免疫、镇痛等作用[10]，其以甘草酸铵为指标成分进行含量测定。6-姜酚是生姜中主要的挥发油成分，具有抗炎、止痛、强心、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤等作用[11]。目前，关于桂枝加芍药汤的研究多为在中医辨证论治方面，而对于化学成分的定量分析鲜有报道。为此，本研究建立了同时测定桂枝加芍药汤中芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚含量的高效液相色谱法（HPLC），旨在为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型可变波长扫描紫外检测器、G1316A型柱温箱、OpenLABC.01.07[27]色谱工作站（美国Agilent公司）；MS105DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

芍药苷对照品（批号：110736-201741，纯度：95.7%）、甘草苷对照品（批号：111610-201607，纯度：93.1%）、肉桂酸对照品（批号：110786-201604，纯度：98.8%）、桂皮醛对照品（批号：110710-201720，纯度：98.0%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201619，纯度：93.0%）、6-姜酚对照品（批号：111833-201303，纯度：98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷对照品（批号：713A022，纯度：98.0%）购自北京索莱宝科技有限公司；甘草素对照品（批号：Z20J8X40265，纯度：98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.3 药材

桂枝饮片（批号：17050502）、赤芍饮片（批号：170201）、炙甘草饮片（批号：170507）均购自山东省中医院，大枣饮片（批号：E2017100901）购自济南东方大药店，生姜购自济南市某超市；经山东中医药大学徐凌川教授鉴定分别为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝、毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根（经蜜烘制后得到）、鼠李科植物枣（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实、姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的新鲜根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：235 nm（0～35 min，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷）、280 nm（35～65 min，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚）；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 桂枝加芍药汤标准煎液的制备

称取桂枝9 g、赤芍18 g、炙甘草6 g、生姜9 g、大枣12枚，加水1 400 mL，武火煎煮，煮沸后调文火保持微沸煎煮，煎煮至药液约600 mL，8层纱布滤过，滤液加水定容至600 mL，即得。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液 取芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并定容，摇匀，得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚质量浓度分别为340、1 148、98、494、610、382、1 400、800 μg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各单一对照品贮备液适量，置于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，摇匀，得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚质量浓度分别为42.5、574.0、73.5、24.7、46.0、19.1、720.0、30.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 取“2.2”项下标准煎液25 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，密闭，称定质量，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理10 min，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按“2.2”项下方法分别制备缺桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大枣的阴性标准煎液，再按“2.3.2”项下方法制备缺桂枝、缺赤芍、缺甘草、缺生姜、缺大枣的阴性样品溶液。

2.4 系统适用性试验

取“2.3”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，理论板数按芍药内酯苷峰计应不低于7 000，分离度均大于1.5，阴性样品对测定无干扰。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，摇匀，得系列线性关系工作溶液。精密量取上述系列线性关系工作溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，各待测成分回归方程与线性范围见表2。

2.6 定量限与检测限考察

精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的定量限分别为0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL，检测限分别为0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL。

2.7 精密度试验

取“2.3.1”项下混合对照品溶液1 mL，置于5 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚峰面积的RSD分别为0.25%、0.45%、1.43%、0.64%、0.32%、1.34%、2.01%、0.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚峰面积的RSD分别为0.45%、0.87%、1.22%、0.65%、1.34%、2.65%、1.43%、0.69%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取“2.2”项下标准煎液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的平均含量分别为0.24、7.35、0.74、0.10、0.15、0.05、1.97、0.07 mg/g，RSD分别为0.62%、0.31%、1.28%、1.12%、1.56%、1.98%、2.73%、0.34%（n= 6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

精密吸取已知含量的标准煎液，共6份，每份2.5 mL，分别加入一定量的单一对照品贮备液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.11 耐用性试验

2.11.1 流动相考察 取“2.2”项下标准煎液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（流动相中磷酸溶液体积分数分别为0.15%、0.10%、0.05%）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当流动相发生一定程度波动时，本法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.11.2 流速考察 取“2.2”项下标准煎液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（流速分别为0.9、1.0、1.1 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当流速发生一定程度波动时，本法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.11.3 柱温考察 取“2.2”项下标准煎液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（柱温分别为20、25、30 ℃）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。结果表明，当柱温发生一定程度波动时，本法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.12 样品含量测定

取“2.2”项下标准煎液25 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表5。

對中药复方制剂进行质量控制时需要同时测定多个成分，而各成分的紫外吸收最大波长不同，因此采用多波长含量测定方法[12]。袁鹏飞等[13]采用HPLC法测定桂枝汤中9种成分的含量，在230 nm波长处检测芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷，在254 nm波长处检测桂皮醛和甘草酸，在280 nm波长处检测没食子酸、香豆素、桂皮酸及2-甲氧基桂皮醛。采用紫外检测器进行含量测定时，一般会选择某种成分的最大吸收波长。在前期试验中，笔者采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内对8个待测成分进行光谱扫描，结果发现芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的最大吸收波长分别为230、230、240、275、285、290、255、282 nm；研究各成分的光谱图，结果发现芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷在235 nm波长处均有较大吸收，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚在280 nm波长处均有较大吸收；综合考虑各成分峰的出峰时间，选择于235 nm（0～35 min）波长处检测芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷，于280 nm（35～65 min）波长处检测甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚。

本试验对甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等不同流动相进行了考察。结果发现，以甲醇-水、甲醇-磷酸为流动相时，20 min附近处有2个峰分不开，以乙腈-水为流动相时，峰形不好，故选择以乙腈-磷酸为流动相；在此基础上，对流动相的浓度和比例进行优化，结果发现乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相行梯度洗脱时分离效果最好，出峰稳定且峰形尖锐，故选择乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

桂皮醛和6-姜酚分别为桂枝和生姜中的主要成分，但二者均为挥发性成分，在煎煮过程中易挥发，故标准煎液中的含量相对较低，但考虑到二者对汤剂整体药效的发挥具有促进作用[14]，故将二者作为指标成分 。

综上所述，本研究所建方法准确、可靠，专属性好，可用于同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量。

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（收稿日期：2018-08-20 修回日期：2018-12-09）

（编辑：陈 宏）