甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建

张超 付三雄 周小婴 唐容 黄莎 杨克相 戚存扣

摘要：【目的】克隆甘蓝型油菜的甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）基因（BnGPDH），分析其表达特性并构建植物过表达载体，为研究该基因在油菜种子三酰甘油（TAG）合成和积累中的作用机制提供理论参考。【方法】以甘蓝型油菜H105为材料，采用同源克隆技术克隆与At3G07690同源的BnGPDH基因，对其进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BnGPDH基因在甘蓝型油菜不同组织[根、茎、叶、蕾、花及花后（DAF）7、14、21、30和40 d角果皮和种子]及高、低油含量自交系角果皮和种子中的表达情况，并将克隆获得的BnGPDH基因连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上构建植物过表达载体。【结果】克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因编码区（CDS）长度均为1338 bp，编码445个氨基酸，其编码蛋白仅有5个氨基酸差异，均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_  Gly3P_dh_C结构域，定位于细胞质，分别与白菜细胞质型GPDH蛋白（XP_009147040.1）和甘蓝细胞质型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列具有较高相似度，对应的相似度为100.00%和99.78%，且二者与双子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较近，与单子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较远。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同组织中均有表达，且表达模式总体上相似，在21DAF和30DAF种子中的表达量显著高于其他组织部位（P<0.05，下同），表明21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期，但在角果生长发育不同时期这2个基因的表達略有不同，且在茎、蕾、种子（7DAF、21DAF、30DAF和40DAF）和角果皮（7DAF和40DAF）中，BnGPDHc2-1基因的表达量均显著高于BnGPDHc2-2基因，而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达量显著高于BnGPDHc2-1基因。21DAF种子中BnGPDHc2-1基因在3个高油含量自交系中的表达量显著高于3个低油含量自交系，BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表达量显著高于3个低油含量自交系;在30DAF种子中，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在3个高油含量自交系中的表达量均显著高于3个低油含量自交系。将BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因分别连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上可成功构建获得植物过表达载体。【结论】BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同发育期角果中行使的功能存在一定分化，在进化过程中可能分别来源于白菜基因组和甘蓝基因组，但均在甘蓝型油菜种子TAG合成和积累发挥重要调控作用。因此，构建的植物过表达载体可用于BnGPDH基因功能分析及油菜种子油含量基因工程改良研究。

关键词： 甘蓝型油菜;甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）;表达特性;生物信息学;植物过表达载体

0 引言

【研究意义】甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是全球广泛种植的主要油料作物之一，提高其种子油脂含量是一个重要的育种目标（王汉中和殷艳，2014）。油脂的主要成分为三酰甘油（TAG），是3-磷酸甘油（G3P）和酰基辅酶A（acyl-CoA）在一系列酶促作用下聚合形成的产物。研究发现，促进acyl-CoA和G3P合成可提高TAG含量（Baud and Lepiniec，2010）。其中，G3P是由甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH或GPD）以糖酵解的中间产物磷酸二羟丙酮（DHAP）为底物催化合成，GPDH是调控G3P合成途径的关键酶（Eastmond，2004）。因此，克隆BnGPDH基因，明确其表达特性，并构建植物过表达载体对油菜种子油脂含量的遗传改良具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关GPDH基因的相关研究报道较多。在酵母中，GPD1和GPD2是甘油合成的限制因子（Remize et al.，2001），其中，沉默GPD1基因表达会导致GPDH活性降低20%，甘油合成量降低19%（He et al.，2014）;在衣藻中，沉默GPD2基因表达会导致其在缺氮条件下TAG合成量减少（Morales-Sánchez et al.，2017），但衣藻超量表达酵母GPD1基因会导致其TAG含量增加67.5%（Wang et al.，2018）。对于高等植物，如甘蓝型油菜过量表达酵母胞质GPDH基因会导致其种子中的TAG合成量增加40%，且DHAP迅速减少（Vigeolas et al.，2007）;亚麻芥植株中被转入AtDGAT1和酵母胞质型GPD1共表达载体后其种子油含量比野生型提高13%（Chhikara et al.，2017）。上述研究表明，GPDH基因在TAG合成中发挥重要调控作用。【本研究切入点】目前，鲜见克隆甘蓝型油菜GPDH基因（BnGPDH），并分析其表达特性与种子TAG积累相关性的研究报道。【拟解决的关键问题】以甘蓝型油菜H105为材料，利用同源克隆技术克隆At3G07690同源基因BnGPDH，对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其组织表达特性及在高、低油含量自交系在TAG积累高峰期角果皮和种子中的表达量，最后构建BnGPDH基因的植物过表达载体，为研究该基因在油菜种子油分积累中的分子调控机制提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试甘蓝型油菜H105及携带甘蓝型油菜napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体（简称pC1300-N）均由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。高油含量自交系IL1130、IL474、IL594及低油含量自交系IL134、IL202、IL525由贵州省油料科学研究所提供。主要试剂：pEASY-T1载体和大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;EZ-10 DNAaway RNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;快速质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶、T4连接酶、PrimeScriptTM RT rea-gent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒等购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1. 2 样品采集

甘蓝型油菜H105种植于贵州省油料科学研究所贵阳实验田，于盛花期标记开放的花朵，并采集根、茎、叶、蕾、花等组织，于角果期采集花后7 d（7DAF）、14 d（14DAF）、21 d（21DAF）、30 d（30DAF）和40 d（40DAF）的角果皮和种子，采集样品后液氮速冻， -80 ℃保存，用于qRT-PCR检测。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

参照EZ-10 DNAaway RNA提取试剂盒说明提取样品总RNA，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nanodrop 2000超微量分光光度計测定其浓度。根据PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明以叶片RNA为模板反转录合成cDNA，用于BnGPDH基因克隆。参照PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明以各组织RNA为模板反转录合成cDNA，用于qRT-PCR检测。

1. 4 引物设计

将At3G07690基因序列与Brassica Database（http：//brassicadb.org/brad/）中的甘蓝型油菜基因组序列进行比对，获取与At3G07690同源的BnGPDH基因序列，设计其编码区（CDS）的特异扩增引物P1和P2（表1），并在引物5'端分别添加BamH I和EcoR I酶切位点（下划线处）。根据克隆得到的BnGPDH基因序列设计qRT-PCR引物（P3/P4和P5/P6），内参基因引物根据BnUBC21（EV086936）序列设计（表1）。引物委托上海英骏生物技术有限公司合成。

1. 5 基因克隆

以甘蓝型油菜H105叶片cDNA为模板、P1和P2为引物克隆BnGPDH基因。PCR反应体系按照Ex Taq说明配制。扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收预期大小（1338 bp）的基因片段，连接到pEASY-T1载体后转化大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性菌株送至北京六合华大基因有限公司进行测序。

1. 6 生物信息学分析

利用DNAMAN对测序结果进行整理，并将测序结果提交至Brassica Database中与甘蓝型油菜参考基因组序列进行比对分析。利用ProtParam预测编码蛋白的理化性质;利用SMART预测蛋白的保守结构域;利用SWISS-MODEL预测蛋白的三级结构;利用TBpred预测蛋白的亚细胞定位。从NCBI下载不同物种GPDH蛋白序列，以MEGA 6.0的ClustalW进行序列分析，并采用邻接法（NJ）构建系统发育进化树，参数设置bootstrap重复1000次，用FigTree处理系统发育进化树图像。

1. 7 qRT-PCR检测

以不同组织的cDNA为模板，按照SYBR® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明配制反应体系，在CFX96 Real-Time PCR Detection System上检测基因相对表达量。扩增程序：95 ℃预变性120 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，进行40个循环。以BnUBC21为内参基因，采用2−ΔΔCt的方法计算相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），3次生物学重复。

1. 8 种子特异表达的过表达载体构建

用BamH I和EcoR I双酶切阳性克隆质粒pEASY-T1-BnGPDHc2-1和pEASY-T1-BnGPDHc2-2及pC1390-N载体，切胶回收BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因片段和线性化的pC1390-N载体后，分别用T4连接酶16 ℃过夜连接，并转化大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定出阳性克隆菌株后提取其重组质粒，双酶切鉴定重组质粒，并送至北京六合华大基因有限公司测序。

1. 9 统计分析

采用Excel 2013进行数据整理及作图，以SPSS 22.0进行差异显著性分析，使用Photoshop CS 6.0辅助制图。

2 结果与分析

2. 1 BnGPDH基因克隆结果

如图1所示，PCR产物长度约1300 bp，与预期结果（1338 bp）相符。测序结果显示，PCR产物有2条BnGPDH基因序列，与At3G07690的同源性均较高，分别为83.65%和83.51%，CDS全长均为1338 bp，其中一条与甘蓝型油菜参考基因组中转录本GSBRNA2 T00059510001（BnaA05g29950D）的核苷酸序列相似度为99.93%，编码的氨基酸序列完全一致，命名为BnGPDHc2-1基因;另一条与转录本GSBRNA2T000389 61001（BnaC05g44270D）的核苷酸序列相似度为99.85%，编码的氨基酸序列完全一致，命名为BnGPDHc2-2基因。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白仅有5个氨基酸差异（图2），氨基酸序列相似度为98.88%。

2. 2 BnGPDH蛋白生物信息学分析结果

BnGPDHc2-1蛋白由445个氨基酸组成，分子量约49.958 kD，理论等电点（pI）为6.50，分子式为C2247H3584N604O645S18，负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）和正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）分别为56和54个。BnGPDHc2-2由445个氨基酸组成，分子量约50.095 kD，pI为6.49，分子式为C2249H3587N605O647S20，负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）和正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）分别为56和54个。蛋白质的保守结构域分析结果显示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白具有相似的结构，均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_Gly3P_dh_C结构域（图2）。亚细胞定位结果显示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白均定位于细胞质中。以2pla.1.A（GPDH1类似蛋白）为模板对BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白进行同源建模，其三级结构如图3所示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2与2pla.1.A三级结构的一致性分别为30.82%和30.49%。可见，克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因为细胞质型GPDH基因。

2. 3 系统发育进化树分析结果

由图4可知，25个物种GPDH蛋白可分为五大类，其中，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2与拟南芥（Arabidopsis thaliana，XP_002882544.1）、亚麻芥（Camelina sativa，XP_010464410.1）、萝卜（Raphanus sativus，XP_018491080.1）、甘蓝（Brassica oleracea，XP_01358317.1）、白菜（B. rapa，XP_009147040.1）及甘蓝型油菜品種中双11（XP_013750519.1）的GPDH蛋白氨基酸序列相似度均在93.00%以上，共处在第Ⅲ类，且BnGPDHc2-1与白菜细胞质型GPDH蛋白（XP_009147040.1）的氨基酸序列相似度为100.00%，而BnGPDHc2-2与甘蓝细胞质型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列相似度为99.78%，由此推测BnGPDHc2-1基因来源于白菜基因组，而BnGPDHc2-2基因来源于甘蓝基因组。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白与第I、II和IV类中各物种GPDH蛋白的氨基酸序列相似度均在80.00%以上，说明GPDH蛋白在种属间保守性较高，但与第V类成员的氨基酸序列相似度均低于80.00%，说明BnGPDH蛋白与双子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较近，与单子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较远。

2. 4 BnGPDH基因在高油含量自交系中的组织表达特性分析结果

由图5所知，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系各组织部位均有表达，且表达模式总体上相似，在21DAF和30DAF种子中表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），蕾和7DAF角果皮中表达量次之，在花中的表达量较低。可见，这2个基因在种子油分积累高峰时期表达最活跃，21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期。在油菜角果生长发育的不同时期，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因的表达略有不同：BnGPDHc2-1在14DAF种子中的表达量显著低于7DAF种子，而BnGPDHc2-2基因在14DAF和7DAF种子中的表达量差异不显著（P>0.05，下同）;BnGPDHc2-1基因在7DAF角果皮中的表达量显著高于14DAF、21DAF、30DAF和40DAF角果皮中的表达量，而BnGPDHc2-2基因在7DAF和14DAF角果皮中的表达量显著高于21DAF、30DAF和40DAF。此外，在茎、蕾、7DAF种子、21DAF种子、30DAF种子、40DAF种子、7DAF角果皮和40DAF角果皮等组织中，BnGPDHc2-1基因的表达量均显著高于BnGPDHc2-2基因，而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达量显著高于BnGPDHc2-1基因，说明BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在不同发育期角果中行使的功能存在一定分化。

2. 5 BnGPDH基因在高、低油含量自交系角果皮和种子中的表达分析结果

由于21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期，因此，本研究系统分析这2个时期BnGPDH基因在高油含量自交系（IL130、IL474和IL594）及低油含量自交系（IL134、IL202和IL525）角果皮和种子中的表达情况，结果如图6所示。21DAF角果皮中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130中的表达量显著高于低油含量自交系IL202，且这2个自交系均显著高于其他4个自交系，30DAF角果皮中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130中的表达量均显著高于其他5个自交系。21DAF种子中BnGPDHc2-1基因在3个高油含量自交系中的表达量显著高于3个低油含量自交系，BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表达量显著高于3个低油含量自交系;在30DAF种子中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在3个高油含量自交系中的表达量均显著高于3个低油含量自交系。可见，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因可能在油菜种子TAG积累中发挥重要作用。

2. 5 植物过表达载体构建结果

将BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因CDS片段分别连接至pC1390-N载体上而构建重组质粒pC1390-N-BnGPDHc2-1和pC1390-N-BnGPDHc2-2，再转化大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定出阳性克隆菌株，提取其重组质粒，并用BamH I和EcoR I进行双酶切，结果发现，双酶切产物中含一段约1300 kb的片段，与目标基因片段大小（1338 bp）基本相符（图7中2和5泳道所示），用Hind III和EcoR I双酶切重组质粒可获得约2400 bp的片段（图7中3和6泳道所示），表明目标基因成功连接至携带napin启动子的植物过表达载体上。

3 讨论

GPDH在植物种子TAG合成过程中发挥重要作用（Vigeolas and Geigenberger，2004;Vigeolas et al.，2007;Chhikara et al.，2017）。近年来，已从蓖麻（弭宪杰等，2011）、水稻（余霞等，2017）、玉米（Zhao et al.，2019）、甘蓝型油菜（胡军，2013;刘少锋等，2017a）等作物中克隆获得GPDH基因，但鲜见与At3G07690同源的BnGPDH基因相关研究报道。本研究从甘蓝型油菜H105中克隆获得BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因，二者编码蛋白的氨基酸序列、理化特性、保守结构域、亚细胞定位和三级结构均高度相似，其中，且BnGPDHc2-1与白菜细胞质型GPDH蛋白（XP_009147040.1）的氨基酸序列相似度为100.00%，而BnGPDHc2-2与甘蓝细胞质型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列相似度为99.78%，推测甘蓝型油菜（AACC，2n=38）是由白菜（AA，2n=20）和甘蓝（CC，2n=18）经自然杂交聚合而成，因此甘蓝型油菜基因组是白菜和甘蓝2个物种基因组的叠加。

本研究发现，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在油菜种子TAG合成和积累的高峰期（21DAF和30DAF）中表达量最高，与刘少锋等（2017b）的研究结果一致，表明该时期BnGPDH基因高效表达可提高油菜种子中TAG合成和积累量。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在蕾和角果发育前期（7DAF）的角果皮中高表达，水稻OsGPDH1基因在生殖发育时期的剑叶中高表达（余霞等，2017），推测BnGPDH基因可能还与植物的生长发育相关。本研究还发现，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在花中的表达量较低，与胡军（2013）的研究结果不同，其原因可能是本研究克隆的BnGPDH基因与胡军（2013）克隆的BnGPDHc1基因不同。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系30DAF种子中的表达量显著高于低油含量自交系，与Fu等（2009）、张超（2012）、Lu等（2018）的研究结果基本一致，表明本研究克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因可能是调控油菜种子TAG合成和积累的关键候选基因。

本研究克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因编码蛋白的氨基酸序列高度相似，仅存在5个氨基酸序列差异，且表达模式总体上相似，但BnGPDHc2-1基因在茎、蕾、7DAF种子、21DAF种子、30DAF种子、40DAF种子、7DAF角果皮和40DAF角果皮等组织中的表达量显著高于BnGPDHc2-2基因，在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达水平显著高于BnGPDHc2-1基因，说明这2个基因在不同发育期角果中行使的功能存在一定分化。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在21DAF和30DAF种子中表达量显著高于其他组织，说明二者均具有种子优势表达的特性，为进一步研究其生物学功能，需构建种子特异表达载体。但采用传统的CaMV35S启动子可能无法准确研究BnGPDH基因在种子TAG合成中的作用。甘蓝型油菜的napin启动子具有种子特异表达的特性（谭小力等，2005;周晓婴等，2012），现已广泛应用种子特异表达载体构建（邹敏等，2012;张超等，2014）。因此，本研究分别构建了BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因种子特异表达的植物过表达载体，将用于甘蓝型油菜的遗传转化，从而进一步开展BnGPDH基因功能分析及油菜种子油含量的基因工程改良研究。

4 结论

BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在不同发育时期角果中行使的功能存在一定分化，在进化过程中可能分别来源于白菜基因组和甘蓝基因组，但均在甘蓝型油菜种子TAG合成和积累中发挥重要调控作用。因此，构建BnGPDH基因的植物过表达载体可用于其基因功能分析及油菜种子油含量基因工程改良研究。

參考文献：

胡军. 2013. 三磷酸甘油脱氢酶基因和甘油代谢对拟南芥种子油含量与根系发育的影响[D]. 武汉：华中农业大学. [Hu J. 2013. Effects of GPDH genes and metabolism on Arabidopsis seed oil content and root development[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

刘少锋，汪慧慧，邬克彬，熊兴华. 2017a. 甘蓝型油菜GPDH基因克隆及其生物信息学分析[J]. 华北农学报，32（2）：109-116. [Liu S F，Wang H H，Wu K B，Xiong X H. 2017a. Cloning and bioinformatics analysis of GPDH in rapeseed[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，32（2）：109-116.]

刘少锋，刑蔓，汪慧慧，邬克彬，官春云，肖钢，熊兴华. 2017b. 甘蓝型油菜甘油三磷酸脱氢酶（BnaGPDH）基因的克隆与表达[J]. 植物生理学报，53（9）：1772-1780. [Liu S F，Xing M，Wang H H，Wu K B，Guan C Y，Xiao G，Xiong X H. 2017b. Molecular cloning and expression profile of BnaGPDH gene in Brassica napus[J]. Plant Physiology Journal，53（9）：1772-1780.]

弭宪杰，徐荣华，刘爱忠，吴丁，田波. 2011. 蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因（RcGPDH）的克隆及功能分析[J]. 中国油料作物学报，33（5）：451-458. [Mi X J，Xu R H，Liu A Z，Wu D，Tian B. 2011. Cloning and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene（RcGPDH） from castor bean[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，33（5）：451-458.]

谭小力，张志燕，伍娟，李家洋. 2005. 油菜种子特异表达启动子NAPIN的功能鉴定[J]. 中国油料作物学报，27（4）：85-88. [Tan X L，Zhang Z Y，Wu J，Li J Y. 2005. Function identification of a seed specific promotor from rapeseed[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，27（4）：85-88.]

王汉中，殷艳. 2014. 我国油料产业形势分析与发展对策建议[J]. 中国油料作物学报，36（3）：414-421. [Wang H Z，Yin Y. 2014. Analysis and strategy for oil crop industry in China[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，36（3）：414-421.]

余霞，余舜武，李天菲，張余，陈守俊，陈晨，李佳，胡颂平. 2017. 水稻OsGPDH1的克隆与功能鉴定[J]. 核农学报，31（5）：829-836. [Yu X，Yu X W，Li T F，Zhang Y，Chen S J，Chen C，Li J，Hu S P. 2017. Cloning and functional identification of OsGPDH1 in rice[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，31（5）：829-836.]

张超. 2012. 油菜甘油-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及功能研究[D]. 南京：南京农业大学. [Zhang C. 2012. Cloning and functional research of glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene from Brassica napus L.[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]

张超，付三雄，陈松，李大雄，戚存扣. 2014. 甘蓝型油菜种子中G3PDH基因特异性表达的ihpRNA载体构建[J]. 贵州农业科学，42（9）：29-34. [Zhang C，Fu S X，Chen S，Li D X，Qi C K. 2014. Construction a seed-specific expre-ssion ihpRNA vector targeting the G3PDH gene of Bra-ssica napus L.[J]. Guizhou Agricultural Sciences，42（9）：29-34.]

周晓婴，申爱娟，张洁夫，浦惠明，龙卫华，胡茂龙，陈锋，付三雄，顾慧，陈松，戚存扣. 2012. RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析[J]. 分子植物育种，10（3）：305-310. [Zhou X Y，Shen A J，Zhang J F，Pu H M，Long W H，Hu M L，Chen F，Fu S X，Gu H，Chen S，Qi C K. 2012. Analysis of seed-specificity of RNAi silen-cing the fad2 gene expression of transgenic rape seed（Brassica napus）[J]. Molecular Plant Breeding，10（3）：305-310.]

邹敏，唐佳佳，宋洪元. 2012. 油菜种子特异启动子Napin控制外源EGFP基因在芥菜中的表达[J]. 中国蔬菜，（14）：18-22. [Zou M，Tang J J，Song H Y. 2012. Expression of EGFP gene controlled by rape seed-specific Napin promoter in transgenic mustard[J]. China Vegetables，（14）：18-22.]

Baud S，Lepiniec L. 2010. Physiological and developmental regulation of seed oil production[J]. Progress in Lipid Research，49（3）：235-249.

Chhikara S，Abdullah H M，Akbari P，Schnell D，Dhankher O P. 2017. Engineering Camelina sativa（L.） crantz for enhanced oil and seed yields by combining diacylglycerol acyltransferase1 and glycerol-3-phosphate dehydrogenase expression[J]. Plant Biotechnology Journal，16（5）：1034-1045.

Eastmond P J. 2004. Glycerol-insensitive Arabidopsis mutants：gli1 seedlings lack glycerol kinase，accumulate gly-cerol and are more resistant to abiotic stress[J]. The Plant Journal，37（4）：617-625.

Fu S X，Cheng H，Qi C K. 2009. Microarray analysis of gene expression in seeds of Brassica napus planted in Nanjing（altitude：8.9 m），Xining（altitude：2261.2 m） and Lhasa（altitude：3658 m） with different oil content[J]. Molecular Biology Reports，36（8）：2375-2386.

He W J，Ye S C，Xue T，Xu S Y，Li W Y，Lu J H，Cao L Y，Ye B Y，Chen Y Q. 2014. Silencing the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene in Saccharomyces cerevisiae results in more ethanol being produced and less glycerol[J]. Biotechnology Letters，36（3）：523-529.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Lu S P，Sturtevant D，Aziz M，Jin C，Li Q，Chapman K D，Guo L. 2018. Spatial analysis of lipid metabolites and expressed genes reveals tissue-specific heterogeneity of lipid metabolism in high- and low-oil Brassica napus L. seeds[J]. The Plant Journal，94（6）：915-932.

Morales-Sánchez D，Kim Y，Terng E L，Peterson L，Cerutti H. 2017. A multidomain enzyme，with glycerol-3-phosphate dehydrogenase and phosphatase activities，is involved in a chloroplastic pathway for glycerol synthesis in Chlamydomonas reinhardtii[J]. The Plant Journal，90（6）：1079-1092.

Remize F，Barnavon L，Dequin S. 2001. Glycerol export and glycerol-3-phosphate dehydrogenase，but not glycerol phosphatase，are rate limiting for glycerol production in Sa-ccharomyces cerevisiae[J]. Metabolic Engineering，3（4）：301-312.

Vigeolas H，Geigenberger P. 2004. Increased levels of glycerol-3-phosphate lead to a stimulation of flux into triacylglycerol synthesis after supplying glycerol to developing seeds of Brassica napus L. in planta[J]. Planta，219（5）：827-835.

Vigeolas H，Waldeck P，Zank T，Geigenberger P. 2007. Increasing seed oil content in oil-seed rape（Brassica napus L.） by over-expression of a yeast glycerol-3-phosphate dehydrogenase under the control of a seed-specific promoter[J]. Plant Biotechnology Journal，5（3）：431-441.

Wang C，Li Y，Lu J，Deng X，Li H，Hu Z. 2018. Effect of overexpression of LPAAT and GPD1 on lipid synthesis and composition in green microalga Chlamydomonas rein-hardtii[J]. Journal of Applied Phycology，30（3）：1711-1719.

Zhao Y，Liu M，Lin H，Li X，Wang F，Yan B，Wei J P，Zhao C J，Li Z T，Xu J Y. 2019. A cytosolic NAD+-dependent GPDH from maize（ZmGPDH1） is involved in confe-rring salt and osmotic stress tolerance[J]. BMC Plant Bio-logy，19（1）：16.

（責任编辑 陈 燕）