一株铁皮石斛内生真菌的鉴定及对株型的影响

王伟英 邱珊莲 邹晖 戴艺民 林江波

摘 要：【目的】对连城冠豸山上生长较好的野生铁皮石斛进行内生真菌的分离，以获得具有促生效果的菌株，为进一步研究瘤菌根菌属与铁皮石斛共生关系奠定基础。【方法】将连城冠豸山野生铁皮石斛根进行消毒后在PDA培养基上，对长出的内生真菌分离纯化，将一株纯化菌株标记为T11，并通过形态特征与5.8SrDNA-ITS分子生物学方法进行鉴定，并将T11菌株接入液体培养基震荡培养7 d，成菌液后浇灌无菌石斛盆栽苗进行共培养6个月，观察石斛株型的变化。【结果】PDA平板上培养的T11菌株的菌落乳白色，形成同心环，菌丝细胞为双核，有隔，含有椭圆形念珠状细胞，即从形态特征初步鉴定为瘤菌根菌属Epulorhiza sp.，为无性态的胶膜菌Tulasnella calospora。以提取 T11菌株 DNA 为模板进行5.8SrDNA-ITS 序列扩增，扩增产物片段长度为630 bp，通过序列比对和系统进化树分析，T11与大花蕙兰植物菌根真菌胶膜菌聚类在同一分支，亲缘关系最为相近，其同源性达到99%。接菌后的石斛苗长势较好，其株高、叶片数和叶宽都显著增加。【结论】从形态特征和分子生物学鉴定得出T11菌株为兰科菌根真菌担子菌的瘤菌根菌属，瘤菌根菌能促进铁皮石斛苗的生长。

关键词：铁皮石斛;内生真菌;5.8SrDNA-ITS

中图分类号：R 282文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）07-837-05

Abstract： 【Objective】An endophytic fungus from its symbiotic Dendrobium officinale plant was identified and studied for its effect on the morphology of the host. 【Method】The fungus was isolated from the disinfected roots of a wild D. officinale plant grown on top of Mt. Guanzhai in Liancheng county. It was further purified on a PDA medium and labeled as T11 to be identified by morphological and 5.8 SrDNA-ITS molecular biological methods. After a 7 d-culture in a shaking flask， the inoculated liquid was added to the aseptically potted seedlings of D. officinale. Growth of the seedlings was observed for 6 months. 【Result】 The milky white T11 colonies on the PDA plate had concentric rings on them. The T11 mycelial cells were binucleate， septate， and elliptical in shape. It was preliminarily identified as an Epulorhiza sp.， an asexual plastic film fungus of Tulasnella calospora. Subsequently， the 5.8SrDNA-ITS sequence amplified from the DNA extracted from T11 as template showed the PCR fragment to be 630bp in length. The sequence alignment and phylogenetic tree clustered T11 in the same branch as the T. calospora of Cymbidium， with a 99% genetic homology. With the T11 inoculation， the D. officinale seedlings grew well with significantly increased plant height， leaf count， and leaf width. 【Conclusion】The morphological and molecular biological characteristics of T11 indicated it to be an Epulorhiza sp.， the Basidiomycetes of orchidaceae mycorrhizal fungi， which is known to enhance the growth of D. officinale.

Key words：Dendrobium officinale; endophytic fungus; 5.8 SrDNA-ITS.

0 引言

【研究意義】铁皮石斛Dendrobium officinale是我国传统名贵中药材，其经济价值和药用价值颇高，具有增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血压等功效。铁皮石斛是一种典型的内生菌根植物，需要与合适的真菌共生才能完成其生活史[1]。内生真菌在铁皮石斛的人工栽培、引种驯化以及资源再生和保护等方面具有重要的作用。

【前人研究进展】兰科菌根系统中存在多种内生真菌类型，主要属担子菌门、半知菌门和子囊菌门[2]，其中担子菌类真菌为优势菌群。担子菌胶膜菌科中的无性态属瘤菌根菌属Epulorhiza sp.以及瘤菌根菌属的有性态胶膜菌属Tulasnella是兰科植物的主要共生真菌[3]。菌根真菌参与兰科植物生长发育过程，主要表现为在自然条件下种子萌发、植株营养生长、生殖繁育均需与真菌共生形成菌根来提供必需的有机质和碳水化合物[4-6]。

【本研究切入点】连城冠豸山铁皮石斛是我国第二个获得地理标志的石斛品种，其品质较好。近年来由于过度采摘导致冠豸山野生铁皮石斛濒临灭绝，因此对冠豸山的铁皮石斛内生真菌菌群研究就显得尤为重要。了解连城冠豸山铁皮石斛的内生真菌的优势种群，对冠豸山铁皮石斛的保护和人工栽培，以及保持其内生真菌资源多样性具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究从连城冠豸山长势较好的野生铁皮石斛根部分离到一株内生真菌T11，通过形态观察和分子生物学方法進行鉴定，并测试T11对盆栽组培苗生长的影响，以期为研究内生真菌与铁皮石斛产量、品质之间的相关性提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为冠豸山野生铁皮石斛，接菌试验所用石斛苗为冠豸山野生铁皮石斛种苗。

1.2 试验方法

1.2.1 石斛内生真菌的分离与纯化

剪取野生铁皮石斛根，用自来水流水冲洗去除表面附着物，晾干表面水分。按常规无菌操作进行表面消毒：75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗1次，无菌滤纸吸干表面水分;0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗2次，无菌滤纸吸干表面水分。在超净台上切成约1 cm长的小段，接入PDA平板培养基上，25℃恒温培养3～7 d。挑取切口处新长出的菌丝尖端，转接到新的PDA培养基上，纯化培养3～5代后获得纯菌株。

1.2.2 石斛内生真菌的形态鉴定

挑取已分离纯化的T11 的新生菌丝，接种到 PDA 平板中央，倒置于 28℃ 的恒温培养箱中培养，观察菌落形态，并记录其菌落大小、颜色、边缘菌丝形态及是否产生色素等特征。根据菌落培养特征和显微形态特征对分离菌株进行初步鉴定。菌种标本保藏于福建省农业科学院亚热带农业研究所。

1.2.3 石斛内生真菌的分子鉴定

采用CTAB法提取内生真菌基因组DNA。采用真菌ITS 序列通用引物ITS1 （5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′） 和 ITS4 （5′-T-CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3′）来扩增5.8S rDNA-ITS基因片段。PCR扩增条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片断，检验产物胶回收情况。将PCR胶回收产物连接到pMD19-T上，转化大肠杆菌，挑选单克隆进行扩繁，对单克隆进行PCR验证，挑选阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测得的 ITS 序列通过 BLAST 软件进行同源序列比较。

1.2.4 石斛盆栽苗的准备

泥炭土高温灭菌后装入未使用过的花盆，将铁皮石斛组培苗种在花盆中，每盆种3丛，每丛3株石斛苗，培育半年后接菌。

1.2.5 菌液培育与接菌处理

配制液体PDA培养液，接入瘤菌根菌，放入摇床，180 r·min-1、28℃，震荡培育7 d后用粉碎机搅碎大块菌丝至均匀，用5 mL移液枪将菌液接种在石斛的根基部，每丛分3点各接5 mL，接12盆。接菌的为处理组，未接菌的为对照组。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学鉴定

基本特征：菌丝细胞为双核。在PDA培养基上菌落表面光滑，边缘整齐，厚薄均匀，无气生菌丝，菌落乳白色，形成同心环，具有香味（图1-A）。菌丝培养7 d，平均生长速度为0.12～0.14 mm·h-1，菌丝具有直角或者锐角分枝，有隔，含有椭圆形念珠状细胞，念珠状细胞链一般5个细胞（图1-B）。按照《真菌鉴定手册》[7]初步认为T11为瘤菌根菌属Epulorhiza sp.菌株。

2.2 菌株的分子鉴定

以提取 T11菌株 DNA 为模板进行 ITS 序列扩增，PCR电泳结果显示，PCR扩增产物在630 bp左右的位置有清晰条带（图2）。对PCR产物进行测序，并将所得核心片段序列（图3）提交至美国国立生物技术信息中心（NCBI）进行Blast比对，选取GenBank中与T11的ITS序列同源性高的系列菌株用于系统发育分析。结果表明，与T11相似性较高的序列主要分布在胶膜菌属。由图4可见，T11与大花蕙兰植物菌根真菌胶膜菌Tulasnella calospora（EF393621.1）聚类在同一分支，亲缘关系最为相近，其同源性达到99%。而胶膜菌真菌对应的无性态即为瘤菌根菌，故可判断该菌株为瘤菌根菌属Epulorhiza sp.。

2.3 T11对铁皮石斛的株型的影响

随机选取各12盘进行试验，接菌前在株型上没有明显差别（图5-A）;石斛苗在接菌共培养3个月后，接菌处理的植株生长较快，其株高、叶片数都与对照的差异极显著，但叶片宽度上没有明显差别（图5-B）;共培养6个月后，接菌植株生长速度较快（图5-C）。由表1可知，3个月株高增加了5.96 cm，而对照只增加了2.68 cm，差异极显著。植株长高后的叶片数也相应增多，接菌植株的叶片数与对照的叶片数差异极显著。叶片宽度变化不大，在3个月时接菌植株与对照的叶宽无明显差异，6个月时接菌植株的叶片宽度大于对照的宽度。试验表明浇灌瘤菌根菌能促进铁皮石斛植株的生长，有效促进了植株高度、叶片数和叶宽的增加，说明瘤菌根菌具有促生作用。

3 讨 论

目前鉴定未知菌主要是根据形态学和分子鉴定的手段来确定，分子鉴定对内生真菌鉴定最有效的方法是对ITS-rDNA序列片段进行分析[8-10]。本研究中的T11真菌形态学特征符合瘤菌根菌属的真菌形态学特征，经诱导未见产孢，为无性型属。通过ITS-rDNA序列比对并构建进化树表明，T11菌株与大花蕙兰植物菌根真菌胶膜菌属亲缘关系最近，而胶膜菌属是瘤菌根菌属的有性态[5]，因此确定本研究中的T11菌株为瘤菌根菌属。

瘤菌根菌属存在于多种兰科植物中，在石斛的生长发育中起着重要的作用。本研究通过接瘤菌根菌于石斛盆栽苗后，从表型观察可以得出瘤菌根菌可促进铁皮石斛的生长，使植株的株高、叶片数和叶宽都有显著增加，这与朱鑫敏[11]研究结果一致，其研究得出接瘤菌根菌可极大地促进铁皮石斛组培苗的生长。内生真菌促进植物生长的原因可能是菌根真菌一定程度上影响了植物的调控系统，使光合作用增强，物质代谢加快[12-13]。也可能是内生真菌与植物根系形成共生關系后促进了根系对物质的吸收[14-15]。

鉴于铁皮石斛是我国珍稀濒危的药材品种，本研究分离鉴定铁皮石斛的内生真菌，不仅丰富了铁皮石斛的内生真菌的种类资源，对揭示连城铁皮石斛道地性形成的因素提供了研究方向，也为今后进一步揭示内生真菌对铁皮石斛的抗性和营养成分等的影响奠定基础，对规模化人工栽培和质量控制都有着重大意义。

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（责任编辑：林海清）