逆转录环介导等温扩增技术检测齿兰环斑病毒

樊荣辉 罗远华 钟淮钦 叶秀仙 黄敏玲

摘 要：【目的】齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）是侵染兰花的主要病毒，严重影响其观赏价值，建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。【方法】本研究根据ORSV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物，经过一系列条件优化，建立了该病毒的RT-LAMP（Reverse Transcription-Loop-mediated Iisothermal Amplification）检测方法。【结果】结果显示该方法能特异扩增ORSV，与其他4种侵染兰花的病毒（建兰花叶病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒）不发生反应;灵敏度为RT-PCR 的10倍。田间检测20份样品中，RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察即可判断样品是否感染ORSV，省去电泳分析的时间，并且增加了在田间的应用价值。【结论】该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。

关键词：齿兰环斑病毒;RT-LAMP; 检测

中图分类号：S 436文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）07-824-05

Abstract：【Objective】To establish a rapid and reliable detection method on Odontoglossum ringspot virus （ORSV）， a major pathogen that seriously affects the ornamental value of orchids. 【Method】 Primers were designed for the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay from the conserved region in the coat protein （CP） gene of ORSV available in GenBank， and its reaction conditions optimized. 【Result】 Using the selected primer， RT-LAMP specifically identified ORSV but not Cymbidium mosaic virus （CyMV）， Bean yellow mosaic virus （BYMV）， Freesia mosaic virus （FreMV） or Cucumber mosaic virus （CMV）. The sensitivity of the assay was 10 times higher than that of RT-PCR， while identical in positive rate on test of 20 specimens. Furthermore， the amplification products of the newly developed method could be visually inspected using SYBR Green I without gel electrophoresis. 【Conclusion】The RT-LAMP assay was considered a specific， sensitive， and rapid method for ORSV detection.

Key words：Odontoglossum ringspot virus; RT-LAMP; detection

0 引言

【研究意义】 齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）是兰花中最严重的病毒之一， 建兰、墨兰等国兰主要以单独侵染ORSV为主。建兰花叶病毒侵染兰花，使植株出现花叶、畸形、坏死及花瓣变色等症状[1]，使品质下降，影响观赏价值，制约兰花产业发展[2-3]。目前尚缺乏有效防治建兰花叶病毒的药剂，最有效的方法是培育无毒种苗，而这就需要对种苗进行病毒检测及鉴定，因此，建立快速、靈敏的检测技术尤为重要。【前人研究进展】目前，病毒检测主要有酶联免疫法[1]和PCR检测法[4-5]等方法。酶联免疫法是目前较常用的一种方法[6]，但存在灵敏度不高和假阳性等缺点。近几年，灵敏度更高的PCR技术已成为常规检测手段[7]，但由于实验设备要求比较高，在基层的检验检疫部门推广应用难。【本研究切入点】环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是应用4条特异性引物，通过Bst DNA聚合酶，在水浴锅中对靶基因进行的一种恒温扩增技术[8]，该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点，摆脱了对PCR仪等昂贵仪器的依赖[9-11]，在基层单位的检测更加方便。【拟解决的关键问题】基于以上优点，本研究针对ORSV 的保守外壳蛋白（CP）基因设计了 4 条特异性引物，建立了检测ORSV的 RT-LAMP 方法，利于向基层检验部门推广。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于福建省农业科学院花卉育种科技创新团队实验室进行。感染建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus（CyMV）、齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）、菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus（BYMV）、小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus（FreMV）、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV）的阳性样品及健康对照样品的叶片均由本实验室保存提供。荧光染料 SYBR GreenⅠ购自北京鼎国公司;Bst 聚合酶、MgSO4购自New England Biolabs（美国）;RNAiso Plus购自 TaKaRa;甜菜碱购自Sigma（美国）;Trizol购自TaKaRa。

1.2 试验方法

1.2.1 RT-LAMP 体系的建立 取待测样品的叶片，按照Trizol方法提取样品的总RNA。根据 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 公布的ORSV较保守的 CP 基因序列為靶标基因（HQ644131）， 设计得到 6 个特定区域的 4 条特异性引物，其中 F3和 B3 为外引物、FIP 和 BIP 为内引物（表 1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系（25 μL）：2.5 μL 10× Bst buffer、4 μL MgSO4（25 mmol·L-1）、4 μL Betaine（5 mmol · L-1）、 4 μL dNTPs（2.5 mmol · L-1）、1 μL Bst 聚合酶（8 U · μL-1）、2 μL FIP（20 μmo·L-1）、2 μL BIP（20 μmol·L-1）、0.5 μL F3（10 μmol · L-1）、0.5 μL B3（10 μmol · L-1）、2 μL ddH2O、2.5 μL cDNA（50 ng·μL-1）。反应条件为：65℃ 60 min，80℃ 5 min。反应产物用2% 琼脂糖凝胶电泳进行分析;或在PCR管盖上加入2 μL的1 000×SYBR GreenⅠ，混匀后目视观察结果。RT-LAMP 结果分析：反应结束后，在不开盖的情况下离心反应管，使染色剂与扩增产物混合，肉眼观察试验结果，或取 10 μL 扩增产物进行 2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统（Bio-Rad SYSTEM GelDoc XR+）上观察并记录结果。

1.2.2 RT-LAMP 扩增产物酶切验证 为了进一步验证 LAMP 扩增的正确性，在设计LAMP 引物时引入了 EcoR Ⅰ酶切位点。将LAMP产物电泳，梯形条带进行胶回收，再用 EcoR Ⅰ酶37℃酶切过夜，连接于PMD18-T载体上，用 JOM109 感受态细胞转化，测序。

1.2.3 RT-LAMP特异性验证和灵敏度检测 分别提取感染CyMV、BYMV、FreMV、CMV、ORSV的阳性样品的总RNA，采用 RT-LAMP技术进行特异性检测。以感染ORSV样品的总RNA为基本模板（160 ng·μL-1），进行 10-1、10-2、 10-3、 10-4、 10-5倍梯度稀释， 分别进行RT-LAMP 和 RT-PCR灵敏度检测。

1.2.4 田间样品检测 应用本研究建立的 RT-LAMP 和 RT-PCR技术，对田间随机采集的10份建兰和 10 份文心兰样品进行检测和验证。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP 体系的建立

通过反应体系的优化，建立了能扩增ORSV的 RT-LAMP 反应体系（图 1），RT-LAMP阳性反应产物梯形的条带，阴性对照未发现条带;在产物中加入 SYBR GreenⅠ，混匀，ORSV RT-LAMP阳性反应产物颜色为黄绿色，阴性对照为橙色。

2.2 RT-LAMP扩增产物酶切验证

将LAMP产物胶回收后，用EcoRⅠ酶切如图2，并进行转化测序，最终得出，酶切出的片段为目标基因F2-B2的序列，包括酶切碱基在内大小为165 bp。证明该体系扩增产物为靶基因。

2.3 RT-LAMP特异性验证和灵敏度检测

以分别感染 CyMV、BYMV、FreMV、CMV和ORSV的样品总RNA为模板，进行RT-LAMP 扩增。如图3所示，只有ORSV有梯状条带，检测结果为阳性，其他样品不产生条带， 说明建立的检测体系对ORSV检测有较好特异性。

对不同浓度稀释后的RNA，分别进行 RT-LAMP 和 RT-PCR 反应。结果显示，RT-LAMP在稀释 1 000倍时，仍能检测出 ORSV，而RT-PCR 在稀释1 000倍时，未能检出ORSV（图 4），表明 RT-LAMP 检测 ORSV 的灵敏度比 RT-PCR 提高了10 倍。

2.4 田间样品检测

随机采取建兰和文心兰样品各10 份，分别进行RT-LAMP 和 RT-PCR检测，结果显示， 两者检测结果一致，建兰有4份样品呈阳性， 文心兰有2份样品呈阳性（表 2），表明 RT-LAMP 检测技术能应用于田间样品。

3 讨论与结论

兰花是中国四大名花之一，代表高贵、典雅，具有极高的观赏和收藏价值。但当病毒病侵染时，植株会出现畸形、坏死，从而造成品质下降，这是制约兰花大规模生产的重要因子。为满足消费需求，培育无病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、准确、高效的检测方法，对阻止病毒病的传播有良好作用;或对脱毒苗进行检测，从根源上预防病毒病也具有重要意义。本试验针对齿兰环斑病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，可以针对性地对兰花脱毒种苗进行检测，从种源遏制病毒病的发生。本研究技术具有较高的应用价值，在基层和现场检测中有很好的应用前景。

目前，病毒检测的常用方法是 PCR和酶联免疫技术，均具有较好的检测效果，但存在耗时长，成本高的特点，不适用于基层检测。与常规 PCR 方法相比，本研究建立的 LAMP 技术，在保持 PCR 技术优点的基础上，不需要特殊仪器，操作简单，不需要热循环，整个过程可以在 60 min 内完成，更加省时。检测结果采用加入 SYBR GreenⅠ目测的方式，检测更快捷方便，因此该方法特别适合在基层中应用。

LAMP 技术使用 4～6 条引物，会进一步增强反应的特异性[12-13]。引物设计至关重要，也较复杂和困难，除要遵循一般引物设计原则外，LAMP 引物设计自身要注意的事项[14]，特别是对于 GC 含量较高序列或较短序列设计更加困难[15]。本试验针对齿兰环斑病毒CP基因设计引物，经验证该引物的特异性良好。同时，本研究建立的检测ORSV的RT-LAMP方法特异性强，用时短，操作简单，灵敏度较高，比常规PCR灵敏度高10倍，对于病毒含量很少的脱毒苗的快速检测方面也有一定的优势。LAMP 方法灵敏度高，容易出现假阳性，因此本研究采用在 RT-LAMP 反应管盖上滴加 SYBR green I 染色剂，待反应结束后在不开盖的情况下直接使染色剂与扩增产物混合，以此减少反复开盖而造成的污染问题。

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（责任编辑：林海清）