酸铝对杉木幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

王培 张家君 刘翠 马志慧 陈宇 林思祖

摘 要：【目的】为了探究杉木在酸铝胁迫下抗氧化酶活性的变化规律及其作用机理，以此为基础探索逆境胁迫下杉木的抗性机制。【方法】通过土培盆栽试验，以1年生杉木实生苗为试验对象，采用0.24 g·kg-1的AlCl3·6H2O模拟铝胁迫、pH 4.0的酸液模拟酸胁迫以及两者共施模拟酸铝复合胁迫，测定幼苗叶片不同胁迫时间（15、30和45 d）的MDA含量和SOD、POD、CAT、PPO等酶活性。【结果】无酸无铝状态下，MDA含量均处于低水平状态，单酸、单铝和酸铝处理皆引发MDA的过量积累，且影响程度是酸铝复合胁迫>铝胁迫>酸胁迫。在单酸、单铝和酸铝处理下，发现POD和SOD酶活性的增长幅度是酸铝复合胁迫>酸胁迫>铝胁迫; CAT和PPO酶活性的增长幅度则是酸铝复合胁迫>铝胁迫>酸胁迫。随着脅迫时间延长，POD、SOD活性均先增后减;CAT活性在铝胁迫和酸铝复合胁迫下先增后减，酸胁迫下逐渐增加;PPO活性则均逐渐增加。【结论】单酸、单铝和酸铝处理对POD、SOD、CAT和PPO活性均产生不同程度的诱导，但同时引发MDA的积累。酸铝复合胁迫对抗氧化酶活性具有一定的协同效应，酸胁迫对POD和SOD活性的促进作用大于铝胁迫，对于CAT和PPO活性，铝胁迫的促进作用则大于酸胁迫。

关键词：杉木;酸铝;抗氧化酶活性;MDA

中图分类号：Q 945.78;S 791.27文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）07-852-06

Abstract： 【Objective】The antioxidant enzyme activities and respond mechanism of Chinese fir （Cunninghamia lanceolata） under acid and/or aluminum stresses were investigated. 【Method】 A pot experiment was conducted to determine the MDA content and SOD， POD， CAT， and PPO activities in one-year-old leaves of Chinese fir seedlings under the stress for 15， 30 or 45 d. At the rate of 0.24 g·kg-1， AlCl3 6H2O was applied to the pots to simulate an aluminum stress， a pH 4.0 acid solution added to simulate an acid stress， and the combination of the two incorporated to simulate an acid-aluminum stress. 【Result】Without the presence of acid or aluminum， the potted seedlings had a low content of MDA in the leaves. However， the addition of acid， aluminum or acid-aluminum combination induced excessive accumulation of MDA with the severities ranking as acid-aluminum stress>aluminum stress>acid stress. The addition also raised the POD and SOD activities in leaves with a rank of acid-aluminum stress>acid stress>aluminum stress， and the CAT and PPO activities in the order of acid-aluminum stress>aluminum stress>acid stress. A prolonged treatment caused an initial increase on the POD and SOD activities followed by a decline; and on the CAT activity similarly under the aluminum or acid-aluminum stress but a steady increase under the acid stress; whereas， a gradual increase on the PPO activity under any of the 3 treatments.【Conclusion】The acid， aluminum or acid-aluminum stress affected the POD， SOD， CAT and PPO activities in the leaves to varying extents and raised MDA accumulation in the leaves of Chinese fir seedlings. There appeared to be a synergistic effect on the activities between acid and aluminum. But alone， the acid stress exerted a greater effect on POD and SOD than did aluminum， whereas， aluminum seemed to be a more formidable adversary than acid for the seedlings on CAT and PPO.

Key words： Chinese fir; acid-aluminum stress; oxidase activity; MDA

0 引言

【研究意义】近年来由于酸雨、工业污染和农业肥料的过度使用而引发的土壤酸化问题愈演愈烈。在我国南方地区土壤多是富铝酸性土壤。生长于酸性土壤的植物易受到营养元素的缺失和重金属毒害（如Mn、Al等）的威胁，其中铝毒害是限制植物正常生长的主要因素[1-2]。地球上铝是仅次于氧和硅的第三大元素，约占地球总量的8.1%，在土壤中主要以铝硅酸盐和氧化铝等形式存在，稳定的固态铝是很难进入植物体内发生铝毒威胁的。但当土壤酸度达到一定数值时，难溶性铝会在氢离子的作用下被活化成可溶性铝，如Al3+、AlOH2+、Al（OH）+2、Al（OH）+3等，其可通过根系进入植物体内破坏细胞结构，抑制根系伸长，扰乱植物正常的营养输送和养分吸收[3-6]。同时有研究表明土壤中的可交换性铝对土壤酸度也具有一定的影响，可间接引发土壤酸化[7]。杉木是我国南方地区常用的经济用材树种，分布范围较广，具有生长迅速、材质细致、易加工和用途广等特点，在全国林业生产中占有举足轻重的地位。由于土壤环境的特殊性以及近年来土壤酸沉降的加剧，杉木在生长过程中易受到铝毒的危害，这严重影响了林木产业的发展。因此探究酸铝复合胁迫对杉木抗氧化酶活性等生理指标的影响，对后期杉木栽培及选育方面具有一定的现实指导意义。【前人研究进展】关于杉木铝毒害的研究已有较多报道，阮少宁等[8]研究发现高浓度的铝使叶片细胞质膜通透性和丙二醛（MDA）含量升高;徐小丽等[9-10]研究结果显示低浓度的铝对杉木生长有促进作用，超过一定范围，生长则会受到抑制造成铝毒害现象;李树斌等[11]研究表明外源养分N、P、K的施加可以提高铝胁迫下杉木幼苗的抗氧化酶活性以缓解铝毒对植物的损伤;Ma等[12]研究发现，不同浓度和不同胁迫时间的铝胁迫对杉木无性系根系中H +、K +、Ca2+和Mg 2+离子流的吸收有不同的影响。【本研究切入点】然而，多数研究侧重于铝毒对植物的危害，与铝毒害密切相关的酸毒害研究却鲜有报道，酸铝复合胁迫对杉木生长发育影响的研究则更少。【拟解决的关键问题】本研究通过土培盆栽试验，使用1年生的杉木实生苗为试验对象，研究杉木幼苗在酸铝复合胁迫下叶片MDA含量和SOD、POD、CAT、PPO酶活性等生理指标的变化规律，以此为基础探索逆境胁迫下杉木的抗氧化酶的抗性机制。结合南方地区杉木的实际生存条件，从另一个角度丰富了杉木铝毒害的研究，从而因地制宜为杉木林的生产、管理和防患酸铝复合胁迫提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选择福建省洋口国有林场杉木3代种子园中的020号杉木家系种子为材料进行育苗，以长势一致的1年生杉木幼苗作为本研究的试验材料。

供試土壤来自福建省三明市沙县水南林场二代杉木纯林。选定具有代表性的取土点后，在选定样地取对角线的3个点挖取土壤剖面，用环刀法分别取0～20、20～40、40～60 cm等3个土层的原样土用于测定土壤的物理性质。随后取3个土层样品，去除杂物密封带回实验室进行化学性质测定。最后在取样点分层等量取土带回实验室用于盆栽实验。

1.2 试验设计

试验采用盆栽法，先将1年生杉木苗移栽盆中适应培养一周，随后进行胁迫试验。以无铝无酸处理作对照，0.24 g·kg-1的AlCl3·6H2O均匀混于土壤中模拟铝胁迫，外源硫（NaHSO3∶ Na2SO3=1∶3）[13]配制成pH 4.0的酸液模拟酸胁迫，共4个处理，每个处理4个重复（表1）。试验地选择在福州市福建农林大学杉木研究中心试验大棚内。随后每隔3 d添加500 mL对应的酸液，每隔15 d取杉木幼苗叶片用于生理指标的测定，分别是15、30、45 d等3个时期。1.3 杉木幼苗生理指标的测定

取0.3 g新鲜的杉木叶片于研钵中，倒入适量液氮研磨叶片至粉末，转移至10 mL离心管中并加入0.1 g PVP、5 mL PBS（0.05 mol·L-1，pH 7.0）和10 μL β-Mercaptoethanol混合摇匀，4℃离心20 min取上清液。TBA比色法测定MDA的含量，NBT光化还原法测定SOD活性，愈创木酚法测定POD活性，邻苯二酚法测定PPO活性，紫外吸收法测定CAT活性。

2 结果与分析

2.1 试验土壤的理化性质

环刀法分别取0～20、20～40、40～60 cm等3个土层的原样土进行土壤的物理性质和化学性质的测定，结果如表2、3。2.2 酸铝胁迫下叶片丙二醛含量的变化

丙二醛（MDA）含量的高低通常是衡量细胞膜质过氧化反应及膜结构损伤程度的标尺，如图1所示，在不同的胁迫处理下，MDA含量均显著增加。无酸无铝状态下，MDA含量均处于低水平状态，单酸、单铝和酸铝处理皆引发MDA的过量积累，且影响程度是酸铝胁迫>铝胁迫>酸胁迫;除此之外，胁迫时间的延长也导致MDA含量增加。结果表明，酸铝胁迫使得杉木叶片细胞中MDA含量大幅度增加，易引发细胞膜损伤，影响细胞正常的生命活动。

2.3 酸铝胁迫下抗氧化酶活性的变化

由图2可以看出，与CK组相比，处理2、处理3和处理4的POD活性整体显著增加，尤其在胁迫30 d时，POD活性分别是对照的4.70、4.26和5.21倍;整体来看，酸铝复合胁迫对POD活性的促进作用最大，其次是酸胁迫，最后是铝胁迫。随着胁迫时间的延长，POD活性先增加后降低，但在45 d时，其酶活性水平仍高于对照组。说明随着胁迫时间的延长，酸铝胁迫对植物的伤害具有一定的累加效应，所以使POD活性水平在45 d时显著降低。

SOD活性的变化趋势与POD的类似（图3），随着胁迫时间的延长，SOD活性先增后减。在30 d时，SOD活性达到最高值，但增幅相对较小，与CK相比，处理2、处理3和处理4的SOD活性分别是对照的1.31、1.26和1.44倍，按影响程度排序是酸铝胁迫>酸胁迫>铝胁迫。表明酸、铝胁迫可一定程度上诱导幼苗SOD活性的提高。

CAT活性的变化趋势如图4所示，酸胁迫下，CAT的活性是随时间逐渐增加的;铝胁迫和酸铝复合胁迫下，CAT的活性随时间先增后减。与POD，SOD相同的是，酸铝复合胁迫对CAT活性的促进作用最大，不同的是，酸胁迫的促进作用要小于铝胁迫。比如在胁迫30 d时，处理2、处理3和处理4的CAT活性分别是对照的2.12、2.73和3.24倍。

如图5所示，PPO活性整体呈现出逐渐上升的趋势。在胁迫45 d时，PPO活性最高，与CK相比，处理2、处理3和处理4的PPO活性分别是对照的4.08、4.10和5.28倍。在酸铝复合胁迫下，PPO活性最强，其次是铝胁迫、酸胁迫。表明相对于单酸来说，单铝胁迫更能刺激PPO活性的升高，两者同时施加，则具有一定的协同效应，诱导酶活性的增强。

综上所述，酸铝复合胁迫对POD、SOD、CAT和PPO活性的诱导均具有一定的协同效应。酸胁迫对POD和SOD活性的促进作用大于铝胁迫，对于CAT和PPO活性，铝胁迫的促进作用则大于酸胁迫。由此推测，POD和SOD活性更易受到铝毒害的影响，CAT和PPO更易受到酸胁迫的影响。

3 讨论与结论

本研究通过盆栽试验，使用1年生的杉木实生苗为实验对象，研究了杉木幼苗在酸铝复合胁迫下叶片MDA含量和SOD、POD、CAT、PPO活性等生理指标的变化规律，以此为基础探索逆境胁迫下杉木的抗氧化酶的抗性机制，期望为杉木林业的可持续发展提供一定的理论支持。当植物遭受外界胁迫时，细胞膜由于外界刺激而发生过氧化反应造成丙二醛（MDA）的积累，因其对细胞的毒害作用，MDA含量反映的是细胞膜损伤程度和膜过氧化作用情况[14]。苏涛等[15]研究表明酸雨会使植物叶片MDA含量增加，且在强酸雨和高浓度重金属复合胁迫下，脂质会发生超强过氧化作用，引起MDA的过度积累和膜结构严重损坏。本试验中杉木幼苗叶片随着酸胁迫的加剧MDA含量增加，随着铝胁迫时间的增加MDA含量增加，表明酸、铝胁迫均会引起杉木幼苗叶片细胞脂质过氧化，进而破坏其生物膜的结构与功能。酸铝复合胁迫下MDA含量显著高于单铝、单酸胁迫，说明酸铝对杉木幼苗的毒害具有叠加作用。

逆境胁迫下，植物体内的活性氧代谢易发生紊乱从而引起活性氧过量积累，导致植物细胞发生过氧化损伤，严重影响正常的生长发育。植物抗氧化酶系统则能有效地清除过量的活性氧自由基，从而维持活性氧的代谢平衡以及保持膜结构，来增强植物对逆境胁迫的抗性，其中包括SOD、POD、CAT等抗氧化酶。SOD作為防御系统首当其冲的保护酶，其作用是分解细胞内积累的超氧化物阴离子自由基O-2，首先通过歧化反应生成了H2O2和O2，随后通过POD和CAT降解H2O2产物，从而降低抗逆过程中产生的有害物质对植物进一步的损害[16-17]。多酚氧化酶（PPO）是一类催化酚类物质氧化成醌和参与木质素形成的含铜金属酶，其活性的增加在一定程度上可以提高植物的抗逆性[18]。许多研究表明，酸、铝胁迫对于植物自身的保护酶系统具有较大的影响。刘强等[19]研究结果显示随着酸铝处理的加剧，芒萁和玉米体内POD和CAT表现为先上升后下降，MDA含量升高，且铝对于植物的毒害要高于酸毒害。吴若菁等[20]的研究表明，随着酸铝胁迫的加剧，SOD、POD活性逐渐上升，当胁迫超过自身的耐受范围，SOD、POD活性反而下降。魏国余等[21]研究发现在酸铝复合胁迫下，酸是引起抗氧化酶活性变化的主要因素，SOD和POD对酸铝处理敏感，具有一定的抗氧化作用，CAT无显著作用，在较低的酸度值下PPO起到一定的抗氧化作用;同时不同耐铝型的桉树抗氧化酶对酸铝敏感度不同，清除活性氧的能力也有所不同。

在杉木幼苗叶片中，随着胁迫时间的延长，POD、SOD活性是先增后减;CAT活性是铝胁迫和酸铝复合胁迫下先增后减，酸胁迫下逐渐增加;PPO活性则各胁迫下均逐渐增加。由此推断，胁迫前期未超出杉木幼苗的耐受范围，一定含量的铝或酸对抗氧化酶的活性具有促进作用，杉木通过增加保护酶活性来减轻逆境伤害，维持活性氧自由基的动态平衡，但到了胁迫后期，时间的延长和酸、铝毒害的加剧使得胁迫超出了杉木自身的耐受范围，POD、SOD活性受到了抑制而降低，说明杉木幼苗在应对酸铝刺激时，POD和SOD的活性首先会受到抑制，CAT和POD可能对酸铝的敏感度要低于POD和SOD，所以仍存在酶活性上升的趋势。除此之外，发现酸铝复合胁迫对POD、SOD、CAT和PPO活性的诱导均具有一定的协同效应，但从酶活性的变化幅度来看，铝毒害对于杉木幼苗POD和SOD活性的影响大于酸的影响，酸毒害对CAT和PPO活性的影响大于铝毒害。

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（责任编辑：林海清）