基于RNA-Seq技术的日本七鳃鳗鳃组织中精氨酸代谢变化的检测与启示

毕玉艳

七鳃鳗作为一种营半寄生方式生存的无颌类脊椎动物，被认为是脊椎动物进化的始祖，其存在至少可以追溯到3.6亿年前[1～2]。自从2004年，一种新型的适应性免疫方式在七鳃鳗中发现后。从此各个领域的研究者纷纷对七鳃鳗的研究表现出很大的研究兴趣，大量的捕捞七鳃鳗用于科学研究，据报道，随着对于日本七鳃鳗的不断研究，日本七鳃鳗的数量在不断减少，如果不改变这种现状，这将会成为七鳃鳗研究领域一项阻碍。本研究通过Illumina高通量测序平台，对日本七鳃鳗的鳃组织进行转录组测序分析，分析七鳃鳗被刺激后精氨酸相关代谢过程的变化。发现在七鳃鳗中存在与精氨酸代谢有关的具有高度同源性的酶，并且发挥着哺乳动物中相关酶相同的作用。精氨酸在日本七鳃鳗被复合抗原刺激后，T淋巴细胞的免疫应答增加，精氨酸的存在是否对这个过程有促进作用，有待进一步研究。

1 材料与方法

从黑龙江省松花江流域同江地区捕捞日本七鳃鳗，将活体日本七鳃鳗置于实验室水族箱中暂养。1 周后选取 24 条健康的个体分成对照组和实验组。其中将实验组用复合抗原浸泡免疫 1 h 而后进行免疫刺激。用0.9%NaCl溶液配制的复合抗原（灭活的啤酒酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄各 1×109 个/mL），使用时稀释至3000倍。实验组需要经过隔一周一次的 2 次加强免疫，最后一次免疫后 3 天取其新鲜的鳃组织。而复合抗原只用于实验组，对照组其他处理方式与实验组相同。

1.1 方法

1.1.1 RNA 样品的提取及 cDNA 文库构建和测序使用

用RNAiso Reagent对日本七鳃鳗复合免疫实验组及对照组鳃囊总 RNA进行提取。将符合测序标准的总 RNA 样本委托北京诺禾致源生物信息科技公司进行双向测序及分析。

1.1.2 转录本的拼接

先去除测序后数据中比例大于10%的含N的原始序列的读书（N 为不能确定的碱基序列）、低质量的读数得到纯净读数。运用短序列拼接的 Trinity 软件进行拼接。

1.1.3 转录组数据处理与注释分析

利用 Blast 软件，将 Unigene在 Nr 蛋白序列数据库中进行序列比对。未注释的Unigene 在 Nt 核酸序列数据库中所搜索到的为同源序列。将 e 值（e-value）的阈值设置为小于1E-10并运用 HMMER3 程序，根据 Pfam数据库中已构建好了的蛋白结构域 HMM统计模型，对 Unigene 进行注释。

1.1.4 基因差异表达分析

以拼接得到的 Unigene 序列作为标准参考序列，应用软件 Bowtie将每个样品的纯净读数与标准参考序列进行比对。将Bowtie 比对的数据结果利用RSEM软件进行统计，进一步得到了每个样品与每个Unigene的纯净度数数量进行比对，通过进行 FPKM 转换来估算基因的基因表达水平。基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的读数数量数据进行标准统一化处理。

2 结果与分析

2.1 七鳃鳗鳃转录组测序序列的转录本拼接及注释

对实验获得的对照组和实验组两个 cDNA 文库进行双向测序分别得到的原始数据进行过滤，Q20和 Q30指标分别高于 96%和 90%，因此测序结果良好。

2.2 七鳃鳗鳃组织中被复合抗原刺激后精氨酸和脯氨酸代谢有关酶的甄选

对参与精氨酸和脯氨酸代谢过程中有关酶进行分析，发现这5个与精氨酸代谢通路相关度较高的5个Unigene。根据统计：精氨酸酶、精氨酸N-甲基转移酶、肌酸激酶、鸟氨酸脱羧酶1、胍丁胺酶的表达量均出现下调的趋势，精氨酸酶和肌酸激酶的表达量降低显著。

3、讨论

精氨酸能够催化L-精氨酸水解生成鸟氨酸与尿素反应的酶。鸟氨酸是合成多胺类物质的前体，日本七鳃鳗机体被复合抗原刺激后精氨酸酶的表达量明显降低，说明抑制了精氨酸的进一步分解为鸟氨酸，继而阻断了鸟氨酸循环。七鳃鳗在被复合抗原刺激后，其机体的T淋巴细胞的免疫应答增加。肌酸激酶在精氨酸代谢途径中是精氨酸代谢的一个中间产物产生所需要的酶，精氨酸在甘氨酸氨基转移酶（GATM）作用下生成胍基乙酸，其在胍乙酸N-甲基转移酶（GAMT）作用下生成了肌酸[5]，继而在肌酸激酶的作用下生成磷酸肌酸。在本研究中肌酸激酶的表达量明显降低，其抑制了肌酸的进一步分解，而胍基乙酸可以在甘氨酸氨基转移酶的作用下合成精氨酸，保证了七鳃鳗在受到病原微生物侵袭时精氨酸浓度高以帮助七鳃鳗机体更快恢复正常水平。本文通过转录组测序技术，发现了日本七鳃鳗再被复合抗原刺激后，精氨酸代谢相关酶的表达量都呈现出不同程度的降低。此外，其他的研究表明，精氨酸可作为一种营养物质帮助动物抗逆，那精氨酸是否能帮助七鳃鳗抗逆有待于进一步研究。

参考文献

[1]Pancer Z，Amemiya CT，Ehrhardt GRA，etc.Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey.[J].Nature，2004，430（6996）：147-180.

[2]Pancer Z，Saha NR，Kasamatsu J，etc.Variable lymphocyte receptors in hagfish.[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（26）：9224-9229.

[3]Grabherr MG，Haas BJ，Yassour M，etc.Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.[J].Nat Biotechnol，2011，29（7）：644-652.

[4]王麗丽，朱 祯，李 霞.精氨酸甲基转移酶及其生物学功能研究进展[J].中国农学通报，2008，24（7）：39-44.

[5]谢东辉，冷双，谢珂，等.胍丁胺酶与相关疾病关系的研究进展[J].生命的化学，2018，38（4）：603-607.