基于线粒体COI基因序列的武汉地区常见麦蚜蚜种鉴定

杨钰慧 谢佳燕 吴聪

摘要：【目的】采用线粒体COI基因序列分析武汉地区常见麦蚜蚜种的遗传组成，探讨基于COI基因序列作为常见麦蚜蚜种分子鉴定的可行性，为田间麦蚜的有效识别和综合治理提供科学依据。【方法】采集武汉市田间和实验室培养的3种麦蚜（禾谷缢管蚜、麦长管蚜和麦二叉蚜），扩增其COI基因后进行测序，并进行遗传距离检测及聚类分析。【结果】3种麦蚜COI基因片段核苷酸组成中碱基C和G的总含量低于碱基A和T的总含量，其中含量最低的碱基为G，具有明显的碱基偏倚性;不同麦蚜的种内遗传距离均小于0.010，种间遗传距离约是种内遗传距离的10倍;聚类分析结果表明，蚜科的所有物种聚为一支，之后又形成3个分支，分属于蚜科的3种麦蚜。【结论】3种麦蚜的分子鉴定与形态学分类结果一致，表明采用COI基因序列可对武汉地区常见麦蚜蚜种进行有效鉴定。

关键词： 麦蚜;COI基因序列;物种鉴定;蚜科

中图分类号： S435.122.2                     文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）08-1742-06

Identification of wheat aphid species in Wuhan based on mitochondrial COI gene sequence

YANG Yu-hui， XIE Jia-yan*， WU Chong

（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan  430023， China）

Abstract：【Objective】This experiment used mitochondrial COI sequences to analyze the genetic composition of co-mmon wheat aphids species in Wuhan， investigated the feasibility of COI gene sequence as molecular identification for common wheat aphid species， and provided reference for effective identification and integrated management of wheat aphids in the field. 【Method】Samples of three different wheat aphids species[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）， Macrosiphum avenae（Fabricius） and Schizaphis graminum] in the field in Wuhan and cultivated in the laboratory were collec-ted. The COI gene were amplified and sequenced. Genetic distance and the clustering were also analyzed. 【Result】In the nucleotide of COI gene fragment of the three wheat aphids，the total content of base C and base G was lower than the total content of base A and base T. The content of base G was the lowest and showed obvious base bias. All intraspecific genetic distances of these aphid species were lower than 0.010， and interspecific genetic distance was ten times more than intraspecific genetic distance of these aphid species. The analysis of clustering showed that all species of Aphidinae were clustered one clade， and then it formed three small clades which were individually clustered by different wheat aphids. 【Conclusion】The molecular identification of these wheat aphids in the field is consistent with the morphological classification. The results suggests that COI gene sequence can identify effectively the common wheat aphids in Wuhan.

Key words： wheat aphid; COI gene sequence; species identification; Aphidinae

0 引言

【研究意義】农业害虫所产生的直接和间接破坏对人类维持作物生产力和营养安全等产生了重要影响。麦蚜是世界各小麦产区的常发性害虫，隶属于同翅目（Homoptera）蚜科（Aphidinae），为多型性昆虫。麦蚜主要寄生在小麦穗部和中上部叶片上刺吸为害，直接造成麦类作物大量减产（李宏德，2016）。麦蚜还可传播麦类病毒（刘艳莉等，2018），间接造成粮食作物严重减产。另外，一些麦蚜已成为入侵物种，对国际粮食生产和贸易产生严重危害（Bass et al.，2014）。麦蚜在我国已连续多年严重发生，对我国小麦的安全生产构成严重威胁（李素娟等，2001）。在我国，危害麦类作物的蚜虫主要有4种（韩松等，2018），在长江中下游地区危害小麦的主要蚜虫是麦长管蚜[Sitobion avenae（Fabricius）]和禾谷缢管蚜[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）]（杜新慧，2014）。长期以来，麦蚜的防治仍以化学防治为主，田间的不合理用药导致麦蚜危害加剧及麦蚜抗药性水平显著上升（王晓军等，2004;李宏德，2016）。由于蚜虫属典型的r-对策昆虫，其生活周期短，营孤雌生殖，具有不同的寄主类型和颜色多型现象（张广学，1999;Shufran et al.，2000），因而对各种生态系统具有较强的生态适应能力;另外，不同麦蚜对作物的取食部位和传毒能力不同，对作物产生的危害程度也不同，对麦蚜的错误识别将影响田间病虫害的有效管理和风险评估。因此，快速、准确地识别不同蚜种，对保障小麦产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】Enders等（2018）研究了土地覆盖、温度和降水等生态因子对麦蚜丰度及传播病毒能力的影响，结果表明其他生态因子可能影响了禾谷缢管蚜和麦长管蚜的丰度和传毒能力;麦二叉蚜（Schizaphis graminum）的丰度受秋季降水和冬季温度的影响，而传毒能力不受这些因素的影响，麦二叉蚜是麦田中病毒传播能力最强的麦蚜。DNA条形码（DNA barcoding）技术是近年来对昆虫进行物种鉴定的新方法。Hebert等（2003a）首次采用COI基因序列对不同物种进行检测，发现该基因能进行有效的物种识别。近几年有关其他昆虫的研究也表明，COI基因片段作为条形码可进行有效识别和物种鉴定。如为确定入境口岸拦截的变叶木上缨翅目蓟马科的Leucothrips是否对美国农业构成入侵威胁，Skarlinsky等（2017）采集美国不同地点和不同宿主的蓟马科Leucothrips成虫和幼虫进行比较分析，发现采集到的成虫间无形态差异，形态学分析鉴定为蓟马科昆虫L. furcatus，但采集的幼虫形态差异明显，经线粒体COI基因和rRNA验证，发现该样本分成2组，第一组仅由幼虫构成，与第二组存在明显遗传差异，第二组样本由幼虫和成虫组成，遗传分化较低且形态高度相似，表明它们构成单一物种，而两组幼虫在形态上的不同和遗传上的差异，表明其可能存在另一种隐蔽物种。Syromyatnikov等（2017）发现形态鉴定不易区分扁盾蝽属物种，因此采用COI基因序列对4种扁盾蝽属有害物种进行检测，结果显示该序列能准确鉴定麦扁盾蝽（Eurygaster integriceps），并开发了能快速鉴定麦扁盾蝽的PCR-RFLP方法。Mackenzie等（2018）采用COI基因序列检测田间常见蚜种中具有抑制马铃薯Y病毒（PVY）传播杀虫剂的特定抗性突变基因的频率，结果表明，在田间采集的45种蚜虫中至少有17种蚜种被认为是PVY的载体，其中，桃蚜是所有检测蚜种中对杀虫剂抗性突变频率最高的物种，是PVY和马铃薯卷叶病毒（PLRV）中最有效的载体物种。【本研究切入点】湖北省是我国南方小麦主产省份，在全国小麦生产中占有重要地位。近年来，由于化学农药的不合理使用，致使麦蚜抗性水平不断增强。因此，如何通过现代生物技术与传统化学防治相结合，对田间麦蚜物种进行有效鉴定及合理利用化学农药和田间综合治理具有重要的实践意义。目前，基于COI基因序列对田间常见麦蚜蚜种进行分析鉴定的研究报道较少。【拟解决的关键问题】对湖北省武汉地区常见麦蚜种类的COI基因序列片段进行扩增及测序，分析不同麦蚜的遗传特征，探讨COI基因序列作为田间常见麦蚜蚜种分子鉴定标记的可行性，为田间麦蚜的有效识别和综合治理提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试禾谷缢管蚜（RP）和麦长管蚜（SA）样品于2017年5月采自湖北省武汉市周边麦田内;麦二叉蚜（SG）为2017年9月采自田间，之后室内采用瑞华HP300G型智能光照培养箱中传代培养。所有样本于-20 ℃保存备用。此外，为进行相关物种间的比较分析，从NCBI下载3种麦蚜的16条COI基因序列及取食小麦的其他3种害虫的COI基因序列进行分析，序列信息见表1。

1. 2 样本DNA提取、PCR扩增及测序

参照萨姆布鲁克和拉塞尔（2002）、杨子祥等（2006）的方法，采用酚—氯仿法提取基因组DNA。利用Foottit等（2008）的引物LepF：5'-ATTCAACCA ATCATAAAGATATTGG-3'/LepR：5'-TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3'（由北京六合华大基因科技股份有限公司合成）扩增COI基因。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 50 s，45～50 ℃每升1 ℃循环5次，50 ℃循环10次，退火1 min，72 ℃ 1.5 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。将扩增产物送至武汉艾康健生物科技有限公司进行纯化和测序。

1. 3 数据分析

对所得COI基因序列采用ClustalX ver.1.83进行多重比对（Thompson et al.，1997），包括NCBI下载3种麦蚜的16条COI基因序列及3条取食小麦的其他害虫（麦红吸浆虫、大青叶蝉和小麦皮蓟马）的COI基因序列（表1），识别COI基因序列后进行不同物种间序列比对分析。利用MEGA 7.0分析3种麦蚜COI基因的序列特征、碱基组成及序列变异情况（Kumar et al.，2016），计算所有序列间的遗传距离，采用邻接法（Neighbour-joining）构建不同麦蚜蚜种间的系统发育进化树，替代模型为Kimura双参数法（Kimura-2-parameter），聚类树分支的置信度选择重复1000次自引导法（Bootstrap analysis）。

2 结果与分析

2. 1 麦蚜COI基因片段的核苷酸组成

对麦蚜的线粒体COI基因序列进行多重比对，得到长度为669 bp的COI基因片段，该片段中未发现碱基插入或缺失。测序分析结果表明，在所有位点中，保守位点有589个（88%）、变异位点80个（12%）。3种麦蚜的碱基平均含量分别为T=40.9%、C=13.9%、A=34.5%和G=10.7%。碱基A+T含量为75.4%，其中第3位点A+T含量为94.1%。碱基C和G的总含量低于碱基A和T的总含量，其中含量最低的碱基为G，但不同麦蚜蚜种间的碱基组成无显著差异（P>0.05）。碱基替换分析结果表明，有615个一致位，29个位点发生了碱基转换，25个位点发生颠换，转换主要发生在T～C之间，颠换主要发生在T～A之间，碱基变异均匀地分布于该序列的各区域。

2. 2 不同麦蚜COI基因序列的遗传结构

对不同麦蚜COI基因序列间的遗传距离进行分析，结果（表2）表明，3种麦蚜COI基因序列间的群体内遗传距离较低，均低于0.010，而所有麦蚜COI基因序列间的平均遗传距离为0.084。种间遗传距离约是种内遗传距离的10倍，种间遗传距离差异显著（P<0.05），而种内差异较小。

2. 3 不同麦蚜COI基因序列的聚类分析结果

基于COI基因序列构建的系统发育进化树（图1）显示，蚜科的3个种聚成一支，其他的麦类害虫各聚成不同的分支;蚜科物种聚成独立的一支后，又形成3个独立分支，分属于蚜科的3种麦蚜，即麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜。3种麦蚜的不同个体各自聚类形成相对独立的分支，且节点支持率较高。

3 讨论

对于小型昆虫蚜虫物种而言，其在不同季节、不同地点和宿主均存在多种生物型、颜色变种和隐存种的可能（Rebijith et al.，2013）。Duan等（2017）研究了禾谷缢管蚜种群生命周期与遗传多态性的关系，结果表明，具有相同生殖方式的禾谷缢管蚜种群表现出相似的遗传结构，而生殖方式不同的群体间遗传差异显著。这些差异将增加形态学鉴定的难度，且消耗大量的鉴定时间和精力。DNA条形码技术为小型昆虫的快速鉴定提供了可能。已有研究表明，COI基因序列作为条形码可有效识别和鉴定不同的昆虫物种（Hebert et al.，2003a;Syromyatnikov et al.，2017），同时可检查不同地理种群的差异。Xu等（2011）扩增了17个地区麦长管蚜种群的线粒体COI基因序列，结果显示，我国北方麦长管蚜种群的遗传多样性高于华南种群，季节对寄主植物的影响可能增强了北方种群的遗传多态性水平。

COI基因为线粒体内的蛋白质编码基因。在本研究中，3种麦蚜的COI基因序列与其他昆虫线粒体DNA序列组成具有相似的特点，COI基因序列中的碱基组成表现出明显的碱基偏倚性（Jermiin and Crozier，1994），序列中未发现碱基缺失或插入现象，可能与COI基因为线粒体蛋白质编码基因满足功能上的需要和三联体密码子结构的限制有关（Hebert et al.，2003b）。在蚜科中，已采用COI基因序列片段作为DNA条形码对取食不同寄主植物的蚜虫进行快速而准确的鉴定。汪珍春等（2013）研究表明，采用DNA条形码快速鉴定常见花卉蚜种具有可行性。温娟等（2013）基于COI基因序列對北京蔷薇科植物上的9属12种蚜虫进行DNA条形码分析，结果显示北京蔷薇科花卉蚜种有83%能通过DNA条形码进行有效区分。Coeur d'acier等（2014）为274种欧洲蚜种构建了DNA条形码数据库，其可对欧洲蚜种进行无偏差分类，简化了80%用于物种鉴定的消耗。Lee等（2015）采用COI基因序列对寄生于同种沙棘植物上形态相似的3种蚜种进行有效区分，并鉴定出一个隐种。

种间和种内遗传距离间的差异程度是COI基因序列作为DNA条形码进行物种鉴定的关键（Aliabadian et al.，2009），在DNA条形码研究中物种划分的参考值为0.02（腔肠动物门除外）（Hebert et al.，2003b）。本研究中武汉市常见麦蚜物种内COI基因的遗传距离差异均低于0.010，且与种间遗传距离的差距在10倍左右，表明该基因序列适用于麦蚜蚜种间的鉴定（Hebert et al.，2003a，2004;Meyer and Paulay，2005）。Shufran和Puterka（2011）采用基于COI基因条形码检验了美国谷物作物上的蚜虫，发现该序列可成功鉴定8种全周期型蚜虫和2种常见谷物蚜虫。本研究以COI基因序列构建麦蚜系统发育进行树，结果显示，蚜科聚成独立的一支，之后又形成3个分支，分属于蚜科的3种麦蚜，麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜个体各自聚类形成相对独立的分支，其他物种也各自聚成独立的分支，物种间界限明晰，分支节点支持率较高，说明麦蚜的COI基因序列分子鉴定与常规分类结果一致，表明该基因对武汉市常见麦蚜物种的鉴定可行。因此，可通过COI基因鉴定技术与传统分类结合的方法，对田间麦蚜物种和其他麦类害虫进行有效鉴定。

4 结论

3种麦蚜的分子鉴定与应用形态学方法分类的结果一致，表明采用COI基因序列可对武汉地区常见麦蚜进行有效鉴定。

参考文献：

杜新慧. 2014. 麦株蚜虫密度对供钾水平的响应及其生理生化机制[D]. 郑州：河南农业大学. [Du X H. 2014. The response of aphids density to potassium levels and its physiological and biochenmical mechanism of wheat[D]. Zhengzhou：Henan Agricultural University.]

韩松，张扬，郭小奇，梁九进，刘爱芝. 2018. 小麦播量和吡虫啉用量对麦蚜防治效果及安全性的影响[J]. 河南农业大学学报，52（5）：728-732. [Han S，Zhang Y，Guo X Q，Liang J J，Liu A Z. 2018. Effects and safety of sowing rate and imidacloprid dosage on control efficacy against wheat aphids[J]. Journal of Henan Agricultural University，52（5）：728-732.]

J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔. 2002. 分子克隆实验室指南[M]. 黄培堂译. 第3版. 北京： 科学出版社： 463. [Sambrook J，Russell D W. 2002. Molecular cloning： A laboratory manual[M]. Translated by Huang P T. The 3rd Edition. Beijing： Science Press： 463.]

李宏德. 2016. 田间麦蚜和实验室麦蚜抗药性毒力测定和生化测定的研究[J]. 甘肃农业，（2）： 33-39. [Li H D. 2016. Study on the virulence determination and biochemical determination of resistance to wheat aphid in field and laboratory[J]. Gansu Agriculture，（2）： 33-39.]

李素娟，刘爱芝，武予清，李世功，鲁晓华，殷花娥. 2001. 小麦不同品种上麦蚜及其天敌的数量变动[J]. 昆虫知识，38（5）： 355-358. [Li S J，Liu A Z，Wu Y Q，Li S G，Lu X H，Ying H E. 2001. Population dynamics of wheat aphids and natural enemies in different wheat varieties[J]. Entomological Knowledge，38（5）： 355-358.]

刘艳莉，王艳芳，赵彦宏，柏新富，刘林德. 2018. 大麦黄矮病毒的生物信息学分析[J]. 南方农业学报，49（9）： 1760-1767. [Liu Y L，Wang Y F，Zhao Y H，Bai X F，Liu L D. 2018. Bioinformatics analysis of Barley yellow dwarf virus[J]. Journal of Southern Agriculture，49（9）： 1760-1767.]

汪珍春，王小兰，郑毅胜，周伯春，姜立云. 2013. DNA条形码快速鉴定广州常见菊花蚜虫[J]. 环境昆虫学报，35（6）： 764-771. [Wang Z C，Wang X L，Zheng Y S，Zhou B C，Jiang L Y. 2013. Rapid identification of aphids on Chrysanthemum plants in Guangzhou based on DNA barco-ding[J]. Journal of Environmental Entomology，35（6）： 764-771.]

王晓军，陶岭梅，张青文. 2004. 麦长管蚜和禾谷縊管蚜对吡虫啉敏感性的比较研究[J]. 昆虫知识，41（2）： 155-157. [Wang X J，Tao L M，Zhang Q W. 2004. Susceptibility of Macrosiphum avenae and Rhopalosiphum padi to imidacloprid[J]. Entomological Knowledge，41（2）：155-157.]

溫娟，陈睿，姜立云，乔格侠. 2013. 基于DNA条形码对北京地区蔷薇科花卉上蚜虫的快速鉴定[J]. 应用昆虫学报，50（1）： 29-40. [Wen J，Chen R，Jiang L Y，Qiao G X. 2013. Rapid identification of aphids on flowering plants of Rosaceae in Beijing based on DNA barcoding[J]. Chinese Journal of Applied Entomology，50（1）： 29-40.]

杨子祥，陈晓鸣，冯颖，缪迎春. 2006. 蚜虫基因组DNA提取方法的改进[J]. 昆虫知识，43（6）： 880-884. [Yang Z X，Chen X M，Feng Y，Miao Y C. 2006. Method improvement for extraction genomic DNA from aphids[J]. Chinese Bulletin of Entomology，43（6）： 880-884.]

张广学. 1999. 西北农林蚜虫志：昆虫纲、同翅目、蚜虫类[M]. 北京： 中国环境科学出版社： 1-8. [Zhang G X. 1999. Northwest agroforestry insect pest： Insecta，Homoptera，Aphididae[M]. Beijing： China Environmental Science Press： 1-8.]

Aliabadian M，Kaboli M，Niijn V，Vences M. 2009. Molecular identification of birds performance of distance-base DNA barcoding in three genes to delimit it parapatric species[J]. PLoS One，4（1）： e4119.

Bass C，Puinean A M，Zimmer C T，Denholm I，Field L M，Foster S P，Gutbrod O，Nauen R，Slater R，Williamson M S. 2014. The evolution of insecticide resistance in the peach potato aphid，Myzus persicae[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，51： 41-51.

Coeur d'acier A，Cruaud A，Artige E，Genson G，Clamens A L，Pierre E，Hudaverdian S，Simon J C，Jousselin E，Rasplus J Y. 2014. DNA barcoding and the associated PhylAphidB@se website for the identification of Euro-pean aphids（Insecta：Hemiptera：Aphididae）[J]. PLoS One，9（6）： e97620.

Duan X L，Peng X，Qiao X F，Chen M H. 2017. Life cycle and population genetics of bird cherry-oat aphids Rhopalosiphum padi in China： An important pest on wheat crops[J]. Journal of Pest Science，90（1）： 103-116.

Foottit R G，Maw H E L，Von Dohlen C D，Hebert P D N. 2008. Species identification of aphids（Insecta：Hemiptera：Aphididae） through DNA barcodes[J]. Molecular Ecology Resources，8： 1189-1201.

Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，deWaard J R. 2003a. Bio-logical identifications through DNA barcodes[J]. The Ro-yal Society Proceedings B，270： 313-321.

Hebert P D N，Ratnasingham S，De Waard J R. 2003b. Barcoding animal life： Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences，270（S1）： S96-S99.

Hebert P D N，Stoeckle M Y，Zemlak T S，Francis C M. 2004. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biology，2（10）： 1657.

Jermiin L S，Crozier R H. 1994. The cytochrome b region in the mitochondrial DNA of the ant Tetraponera rufoniger： Sequence divergence in Hymenoptera may be associated with nucleotide content[J]. Journal of Molecular Evolution，38（3）： 282-294.

Kumar S，Stecher G，Tamura K. 2016. MEGA7： Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biologyand Evolution，33： 1870-1874.

Lee Y，Lee W，Lee S，Kim H. 2015. A cryptic species of Aphis gossypii（Hemiptera：Aphididae） complex revealed by combined morphological，and molecular data[J]. Bu-lletin of Entomological Research，105： 40-51.

Mackenzie T D B，Arju I，Poirier R，Singh M. 2018. A genetic survey of pyrethroid insecticide resistance in aphids in New Brunswick，Canada，with particular emphasis on aphids as vectors of potato virus Y[J]. Journal of Economic Entomology，111（3）： 1361-1368.

Meyer C P，Paulay G. 2005. DNA Barcoding： Error rates based on comprehensive sampling[J]. PLoS Biology，3（12）： 2229-2238.

Rebijith K B，Asokan R，Kumar N K，Krishna V，Chaitanya B N，Ramamurthy V V. 2013. DNA barcoding and elucidation of cryptic aphid species（Hemiptera： Aphididae） in India[J]. Bulletin of Entomological Research，103（5）： 601-610.

Shufran K A，Burd J D，Anstead J A，Lushai G. 2000. Mitochondrial DNA sequence divergence among greenbug （Homoptera：Aphididae） biotypes：Evidence for host-adapted races[J]. Insect Molecular Biology，9（2）： 179-184.

Shufran K A，Puterka G J. 2011. DNA barcoding to identify all life stages of holocyclic cereal aphids（Hemiptera： Aphididae） on wheat and other poaceae[J]. Annals of the Entomological Society of America，104（1）： 39-42.

Skarlinsky T L ，Rugman-Jones P ，Funderburk J ，Stouthamer R，Ujueta C S. 2017. Adult identity crisis in Leucothrips （Thysanoptera：Thripidae） associated with the tropical ornamental plant Codiaeum variegatum（Euphorbiaceae）[J]. Florida Entomologist，100（3）： 509-514.

Syromyatnikov M Y，Golub V B，Kokina A V，Soboleva V A，Popov V N. 2017. DNA barcoding and morphological analysis for rapid identification of most economically important crop-infesting sunn pests belonging to Eurygaster Laporte，1833（Hemiptera，Scutelleridae）[J]. Zookeys，706： 51-71.

Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，Jeanmougin F，Higgins D G. 1997. The CLUSTAL-X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，25（24）： 4876-4882.

Xu Z H，Chen J L，Cheng D F，Liu Y，Francis F. 2011. Gene-tic variation among the geographic population of the grain aphid，Sitobion avenae（Hemiptera： Aphididae） in China inferred from mitochondrial COI gene sequence[J]. Agricultural Sciences in China，10（7）： 1041-1048.

（責任编辑 麻小燕）