羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌

肖稳 张海韵 杨滔 贺燕 严礼 高晗

摘 要：基于传统的沙门氏菌检测方法检测周期长、效率不高等缺陷，本研究通过合成一种羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米材料，采用一种新的基于分子信标共价功能化的壳聚糖技术和金纳米团聚比色的方法对含SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。在羧甲基壳聚糖上交联环状结构的适配体，当加入靶标之后，由于靶标与环状结构适配体结合导致分子信标刚性结构崩解，插入茎状结构中的金纳米颗粒（GNRs）释放出来，当在溶液中加入一定量的NaCl溶液后，金纳米颗粒会发生团聚，根据聚合度的不同，产生相应颜色变化，从而实现对含SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌的快速检测，结果表明：通过检测金纳米颗粒发生的显色反应的吸光度可以实现对含有SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌进行快速检测，并且这种方法具有较高的特异性和灵敏度。在此检测体系中，靶标浓度和显色反应的吸光度值在0.05～0.5μmol/L内具有良好的线性关系，并且对于靶标DNA的检测下限为50nmol/L。

关键词：生物传感器;鼠伤寒沙門氏菌;分子信标

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种具有较为严重威胁的肠道致病菌[1-2]，而鼠伤寒沙门氏菌毒力岛基因所表达产生的毒力蛋白和毒素能够导致这些症状的发生[3-4]。SSeC基因是位于鼠伤寒沙门氏菌毒力岛-2上的基因，它所表达的毒素蛋白能够引起宿主发生一系列多器官的功能障碍。因此，SSeC基因可以作为检测鼠伤寒沙门氏菌的重要的标记物[5]。传统的沙门氏菌培养和检测技术又称国标法，该种方法是建立在以从样品中分离培养为基础的常规方法上。一般来说，传统的检测技术结果是准确、可靠的，但需经过预增菌以及生化试验、血清学试验等一系列复杂繁琐的操作，检测周期一般需要5～7d才能完成，因此检测效率较低[6]。本实验旨在研究一种能够对鼠伤寒沙门氏菌进行快速检验且具有良好的灵敏度和特异性的方法，通过合成了一种羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米材料作为生物传感器，采用一种新的基于分子信标共价功能化的壳聚糖技术和金纳米团聚比色的方法对含SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

羧甲基壳聚糖，Ballancom Life Sciences Dep;浓盐酸，株洲市星空化玻有限责任公司;浓硝酸，株洲市石英化玻有限责任公司;氯金酸，南京化学试剂股份有限公司;柠檬酸三钠，无锡市民丰试剂厂;1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC），Aladdin;N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），Aladdin;无水乙醇，天津市福晨化学试剂厂;氯化钠（NaCl），国药集团化学试剂有限公司;氯化钾，湖南试剂厂;12水磷酸氢二钠，天津市化学试剂六厂;磷酸二氢钾，天津市福晨化学试剂厂;磷酸二氢钠，天津市化学试剂六厂;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物，杭州微生物试剂有限公司;适配体，生工生物工程（上海）股份有限公司。

核酸序列：分子信标：NH2-GCGCTCGGCCTCCTCTGCCATCTCATTCGCGAGCC;靶标DNA：CGAATGAGATGGCAGAGGAGGC;1个错配序列：CGAATGAGATGGCAGAGGAGTC;4个错配序列：CGGACGAGATGGAAGAGGAGTC;5个错配序列：CGGGCGAGATGGAAGAGGAGTC。

1.2 仪器

磁力加热搅拌器（HSC-19），Joanlab群安实验仪器有限公司;型定时电动搅拌器（JJ-1），江苏正基仪器有限公司;高速微量离心机（D3024），Dragonlab大龙兴创实验仪器有限公司;往复式水浴恒温振荡器（SHA-C），常州澳华仪器有限公司;双光束紫外可见分光光度计（T9CS），北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米金的制备 向量筒中加入300mL浓盐酸，再加入100mL浓硝酸，待1h左右不冒气泡，颜色变为酒红色即为可使用的王水。配制1%的氯金酸溶液，38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，4℃避光保存。吸取1%氯金酸1.65mL于锥形瓶中，加入38.35mL水，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器上进行避光回流（锥形瓶上接冷凝管），锥形瓶中放入搅拌子，同时磁力搅拌，待溶液沸腾，立即加入6.4mL 38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，继续避光回流，加热搅拌，保持沸腾15min。移除热源，搅拌至冷却，得到酒红色的分散状态的纳米金溶液。用0.22μm针头式水溶性过滤器过滤纳米金溶液后，避光4℃保存备用。

1.3.2 羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料制备条件的优化 配制浓度为30mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液。向溶液中加入NHS 0.17g，搅拌15min，然后在2℃冰水浴搅拌器中，以800r/min搅拌下，缓慢滴入EDC的水溶液（0.26g EDC在15mL离心管中，加入5mL去离子水溶解）。10min滴加完成后，仍在冰水浴下继续搅拌反应1h，使羧甲基壳聚糖的羧基充分活化。为了探索羧甲基壳聚糖和分子信标的最佳质量比，我们设计了10个质量比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10加入分子信标（适配体）至上述溶液中，处理1h。得到羧甲基壳聚糖-分子信标复合物。每一个不同的质量比进行3次重复实验。取1mL自制纳米金溶液于 EP管中，4℃、10 000r/min离心10min，弃上清，重悬。向上述纳米金溶液中加入配好的羧甲基壳聚糖-适配体复合物100μL，混匀，置于37℃摇床中孵育30h。为除去可能过量的适配体，将上述混合液在4℃、10 000r/min离心10min，弃上清，最终得到羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料，4℃避光保存备用。

1.3.3 靶标DNA检测 取EP管，加入配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物100μL，加入靶标DNA，使靶标DNA终浓度为0、50、100、200、300、400、500nmol/L，于37℃孵育30min。加入1.5mol/L的NaCl溶液使释放出的GNRs团聚，观察溶液，若有颜色变化（红变蓝），则实验可行。用紫外可见分光光度计检测最大吸收波长（520nm左右）的吸光度A值，每个浓度进行3次重复实验，取3次重复实验A值的平均值绘制标准曲线，进行定量测定。

1.3.4 错配实验 取5个EP管，分别为空白对照组、目标组、1个错配、4个错配、5个错配组。每管加入配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物100μL，将相同浓度的目标DNA序列和3种不同错配的DNA序列分别加入相同的反应体系中进行检测。每个组进行3次重复实验，取平均吸光度值进行比较，如果目标组吸光度值最高，空白和错配均低于目标组较多，空白和错配组差别不大，则证明该方法有选择性和特异性。

1.3.5 样品检测 将鼠伤寒沙门氏菌在液体营养培养基中36℃培养24h，经平板计数后，将不同浓度的菌体（105～108CFU/mL）95℃水浴15min，置冰上10min以获取相应的ssDNA作为实验组，空白样品作为空白对照组，在实验组和对照组中分别加入100μL配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物，于37℃摇床孵育1h，对照组不加菌液，其余条件相同。分别加入1.50mol/L的NaCl溶液，混匀，观察溶液颜色变化，用紫外分光光度计检测最大吸收波长（520nm左右）的吸光度A值，进行定量测定。另外，取金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌（5×107CFU/mL）的DNA在相同的条件下进行样品检测以证明该方法对于鼠伤寒沙门氏菌的特异性。

2 结果与分析

2.1 羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料制备条件的优化

如果在反应体系中存在有处于游离状态的分子探针，就会有可能造成出现假阳性的检测结果，因此，进行分子信标和羧甲基壳聚糖的最佳比例分析是非常有必要的[7-8]。本研究将羧甲基壳聚糖的浓度设为30mg/mL，探讨上述10种不同的分子信标/羧甲基壳聚糖的比例，分别制备形成羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料后加入1.50mol/L的NaCl溶液，混匀，观察溶液颜色变化，用紫外分光光度计检测最大吸收波长（520nm左右）的吸光度A值。当两者的比例小于1∶4时，吸光度值基本上变化不大，但是当比例大于1∶4时吸光度值骤然上升。这表明当分子信标/羧甲基壳聚糖的比例小于1∶4时，分子信标完全结合到羧甲基壳聚糖上，体系中不存在游离的分子信标。当分子信标/羧甲基壳聚糖的比例大于1∶4时，羧甲基壳聚糖的表面已经完全被分子信标所覆盖，体系中存在剩余游离的分子信标，故导致吸光度A值迅速上升。1∶4的比例表明形成的羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料造成强大空间位阻以阻止分子信标进一步结合，因此，1∶4是两者的最佳比例（图1）。

2.2 靶标DNA检测

如图2所示，随着靶标DNA浓度的增加，溶液的吸光度值也不断增加，在靶标DNA浓度为0.05～0.5μmol/L内与吸光度值呈线性关系，表明该方法在一定范围内可以对靶标DNA进行定量检测，按照3S/K计算出该方法对靶标DNA的检测下限可达50nmol/L。

2.3 错配实验

如图3所示，在加入了靶标DNA之后体系的吸光度值显著增加，这是由于靶标DNA使分子信标发生解崩，插入茎状结构中的金纳米颗粒（GNRs）释放出来。而在加入了错配的碱基序列时，吸光度值远远低于靶标，即使只有1個碱基的差别，靶标吸光度值还是错配碱基序列的近3倍。这说明该检测方法对于鼠伤寒沙门氏菌具有很好的选择性和特异性，它应该能够很好地分辨出不同于鼠伤寒沙门氏菌的其他血清型沙门氏菌，并且反应迅速。

2.4 样品检测

以空白对照组样品的吸光度值进行调零，检测各组不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，105～108CFU/mL随着浓度的不断上升，各组的吸光度值也不断增大（图4）。

此外，取不同类别的浓度为107CFU/mL的细菌在相同的条件下进行检测，如图5所示，加入鼠伤寒沙门氏菌的吸光度值远远大于其他3种细菌，表明只有含有SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌才能使靶标DNA分子信标解崩释放出金纳米粒子，从而产生显色反应，从而说明该检测方法对于鼠伤寒沙门氏菌具有较强的特异性。

3 结论

本研究设计了一种新颖的、快速的基于分子信标共价功能化的壳聚糖技术和金纳米团聚比色的生物传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌，该传感器用于检测含有SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌其检测下限可以达到50nmol/L，并且在DNA浓度为0.05～0.5μmol/L内具有良好的线性关系，检测下限低于一些文献报道的结果[9-10]，并且该种检测方法具有较好的选择性和特异性。该检测方法用于鼠伤寒沙门氏菌的检测相比于传统沙门氏菌检测方法具有更高的检测效率，但是本研究也存在一定的局限性，如未能实现对于鼠伤寒沙门氏菌的定量检测，检测的对象也仅只限于鼠伤寒沙门氏菌这一种血清型。实现对于沙门氏菌的快速、定量检测有待进一步深入探讨和研究。

参考文献

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[10]刘柯驿.基于适配体信号放大技术的沙门氏菌快速检测方法的研究[D].长沙：湖南师范大学，2016.

Abatract：Based on the defects of traditional Salmonella detection methods such as long-term，low-efficiency，a novel carboxymethyl chitosan-molecular beacon-gold nanomaterial was synthesized.Salmonella typhimurium containing SSeC gene was detected by a novel chitosan technique based on covalent functionalization of molecular beacons and gold nano-agglomeration colorimetric method.The aptamer of the cyclic structure was cross-linked on carboxymethyl chitosan.After the target was added，the molecular beacon rigid structure disintegrates due to the binding of the target to the cyclic aptamer，and the gold nanoparticle inserted into the stem structure is inserted.The particles （GNRs）were released.When a certain amount of NaCl solution was added to the solution，the gold nanoparticles would agglomerate，and corresponding color changes would be produced according to the degree of polymerization，thereby realizing rapid detection of Salmonella typhimurium containing SSeC gene.The experimental results showed that the rapid detection of Salmonella typhimurium containing SSeC gene would be achieved by detecting the absorbance of the color reaction of gold nanoparticles，and this method had high specificity and sensitivity.In this detection system，the target concentration and the absorbance value of the color reaction had a good linear relationship in the range of 0.05 μmol/L to 0.5 μmol/L，and the detection limit for the target DNA was 50 nmol/L.

Keywords：biological sensor; Salmonella typhimurium;molecular beacon

（責任编辑 唐建敏）