运用SRAP分子标记对胡麻杂交种纯度的鉴定研究

李闻娟 齐燕妮 王利民 党照 赵玮 张建平

摘要：以胡麻杂交种陇杂1号、陇杂2号及其父母本自交系为试材，从9对引物中筛选出2对M10/E3和M2/E5分别进行SRAP分析。结果表明，在陇杂1号母本1S和父本873中均能扩增出至少1条特征带。陇杂1号与父母本相比均有差异带，陇杂2号中产生双亲互补带型。这2对引物均可应用于陇杂1号和陇杂2号的纯度鉴定。

关键词：胡麻;杂交种;SRAP分子标记;纯度鉴定

中图分类号：S565.9         文献标志码：A         文章编号：1001-1463（2019）09-0059-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.09.014

Abstract：PCR -DGGE cloning sequencing technology was used to analyze and compare the bacterial community structure，richness index and diversity index of soil bacteria in rice-rape rotation cultivation layer. Through the analysis of the DGGE profiles concluded that biogas slurry in successive years application does not favor the rich soil bacterial community diversity， when biogas slurry application of total amount controled in 339.31～396.81 t/hm2， bacterial community diversity increases， bacterial population feature rich， complicated information and population stable， too high or too low application of biogas slurry can significantly reduce the bacterial community diversity; According to UPGMA analysis， the genetic similarity of soil bacteria decreased after long-term continuous application of biogas slurry， and the bacterial population structure changed bigger and bigger.

Key words：Rice-rape rotation; Amount of biogas slurry; Bacterial community diversity; PCR-DGGE.

胡麻（Linum usitatissimum）是油用亚麻的俗称，是中国北方重要的油料作物之一，属于亚麻科亚麻属[1 - 3 ]。目前，亚麻杂交种纯度主要依靠田间种植鉴定法，但田间形态学观察鉴定生长周期长，易受环境和人为因素的影响，结果往往不准确[4 ]。分子标记技术的发展为杂交种纯度鉴定提供了新的方法。相关序列扩增多态性（SRAP，Sequence-related amplified polymorphism）是一种新型的基于PCR的分子标记技术，由Li等[5 ]提出，采用独特的引物设计对开放阅读框（open reading frames）进行扩增，由于不同物种间和个体间以及内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。与AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单重复序列标记）、RAPD（随机扩增多态性DNA标记）等分子标记相比，SRAP具有操作简单，成本低等优点，已被广泛的应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析及品种鉴定等领域[6 ]。目前应用SRAP分子标记对胡麻杂交种进行 纯度检验的报道较少。我们筛选出9对多态性好的SRAP引物对胡麻品种陇杂1号和陇杂2号以及父母本进行扩增，通过SRAP分子标记的鉴定，以提高胡麻杂交种纯度检测的准确性。

1   材料与方法

1.1   供试材料

供试胡麻品种陇杂1号、陇杂2号及其父母本均由甘肃省农业科学院作物研究所胡麻课题组提供。

1.2   引物和试剂

SRAP引物由北京金唯智生物技术有限公司合成（见表1），所用Mg2+、Taq酶、dNTPs和Buffer均购自天根生物技术有限公司。

1.3   试验方法

1.3.1    DNA的提取    胡麻基因组DNA提取采用改良CTAB法[7 ]。单株采摘亚麻幼嫩叶片提取DNA，然后进行DNA溶液浓度与纯度检测，稀释为30 ng/μL，-20 ℃下保存。

1.3.2    SRAP-PCR扩增的反应条件    PCR扩增反应的总体积为25 μL：体系包含10×PCR Buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+ 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 3 μL、2.5 U Taq 酶0.5 μL、30 ng/μL 模板DNA 2 μL 以及25 ng/μL 引物各1 μL，其余用ddH2O補足。

相应PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 S，34.5 ℃退火20 S，72 ℃延伸60 S，共5个循环;94 ℃变性45 S，50 ℃退火20 S，72 ℃延伸60 S，共38个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3    扩增产物电泳    扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。每孔上样量定为6.0 μL，电压100 V（4 V/cm）电泳60 min，电极缓冲液为1×TBE。0.05% EB染色，紫外凝胶呈像系统下观察、照相和分析。用100 bp DNA Marker作为分子量的标准。

2   结果与分析

2.1   SRAP多态性分子标记分析

通过图1可以看出，筛选出的9对引物分别在2個胡麻杂交种和父母本之间存在扩增条带的多态性。M10/E7扩增的条带数为11条，多态性比率为18%;M10/E3扩增条带数为13条，多态性比率为31%;M1/E9扩增的条带数为11条，多态性比率为18%;M4/E3扩增的条带数为13条，多态性比率为46%;M3/E2扩增的条带数为9条，多态性比率为33%;M3/E16扩增的条带数为11条，多态性比率为18%;M2/E5扩增的条带数为9条，多态性比率为67%;M6/E6扩增的条带数为9条，多态性比率为33%;M3/E10扩增的条带数为10条，多态性比率为40%;平均每个引物组合扩增的清晰条带数为11条，多态性比率为34%。从这9对SRAP引物中筛选出2对引物M10/E3和M2/E5，在父母本扩增中出现差异条带，在杂交种与其父母本扩增中均有差异条带，且条带清晰明亮，重复性高。可用于2个胡麻杂交种和其父母本之间扩增。

2.2   引物筛选结果

用引物M10/E3对陇杂1号、陇杂2号及其父母本自交系的SRAP检测结果（图2）表明，在母本1S中扩增出1条特征带，此特征带能将母本与父本和杂交种区分开。父本873中扩增出2条特征带，此特征带能与杂交种区分开。杂交种陇杂1号与父母本相比都有差异带。用引物M2/E5对陇杂1号、陇杂2号及其父母本自交系的SRAP检测结果（图3）表明，在母本1S中扩增出1条特征带，在父本陇10中扩增出1条特征带，在杂交种陇杂2号中产生双亲互补带型。因此，这2对引物可应用于陇杂1号和陇杂2号的杂交种纯度鉴定。

2.3   纯度鉴定

通过用引物M10/E3对陇杂1号20粒种子的SRAP电泳检测结果（图4）可以看出，陇杂1号与父母本均有特征带。陇杂1号 F1代杂交种种子为20粒，其中样品17、22、23、24均未检测出特征带，因此，杂交种纯度为80%。用引物M2/E5对陇杂2号20粒种子的SRAP电泳检测结果（图5）可以看出，陇杂2号产生双亲互补带型，F1代杂交种种子总数为20粒，其中有双亲互补带型的有18个，与父本带型相同的是9、11、24，杂交种纯度为85.7%。SRAP鉴定结果与田间种植鉴定结果基本一致，说明运用SRAP分子标记检测胡麻杂交种纯度鉴定可行。

3   小结与讨论

从9对引物中筛选出2对M10/E3和M2/E5，分别对胡麻品种陇杂1号、陇杂2号及其父母本自交系进行SRAP分析。结果显示，在母本1S和父本873中均能扩增出至少1条特征带。杂交种陇杂1号与父母本相比均有差异带，杂交种陇杂2号产生双亲互补带型。这2对引物均可应用于陇杂1号和陇杂2号的杂交种纯度鉴定。

分子标记技术已经越来越广泛地被应用到种子纯度鉴定中[8 ]，SRAP通过聚合酶链式反应，对基因的启动子、外显子和内含子进行扩增，与SSR、RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术相比有很大优势[9 ]，但是在采集材料和提取DNA的时要注意避免交叉污染，才能保证检测结果的准确性。

参考文献：

[1] 杜彦斌，王立军，张   金，等.  胡麻新品种天亚11号选育报告[J].  甘肃农业科技，2018（2）：24-26.

[2] 李闻娟.   胡麻Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD2）基因的表达分析[J].  甘肃农业科技，2018（10）：13-16.

[3] 杨   丽，祁双桔，王宗胜，等.  11个胡麻品种在平凉 旱地引种初报[J].  甘肃农业科技，2016（11）：56-58.

[4] 赵欣欣，赵晓东，王   奇，等.  利用SRAP标记快速检测西瓜杂交种子纯度[J].  新疆农业科学2017，54（9）：1621-1626.

[5] LI G，QUIROS C F.  Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].  Theor. Appl. Genet.，2001，103（3）：455-461.

[6] 石紫薇，梁   妍，姜婷婷，等.  正交设计优化青蒿SRAP-PCR 反应体系及引物筛选[J/OL].  分子植物育种，2019（6）：1-16[2019-08-26].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068. S.20190621.1045.002.html.

[7] KIDWELL K K，OSBORN T C.  Simple plant DNA isolation procedures[M]// Beckman J S，Osborn T C（Eds.）.  Plant genomes： Methods for genetic and physical mapping. Netherlands： Kluwer Academic Publishers，1992：1-13.

[8] 杨晓琴，祝水金.  种子质量控制现状与对策[J].  种子，2005，24（8）：99-100.

[9] 田筑萍，唐   容，吴有祥，等.  利用SSR指纹图谱技术对杂交油菜种质鉴定的研究[J].  种子，2008，27（6）：69-71.

（本文责编：陈     伟）