南海海域养殖牡蛎中麻痹性贝类毒素分析

王媚　吴移山　林华娟

摘要：本研究在2013年3月采集湛江、阳江、钦州、北海、汕头、汕尾、深圳、台山等8个位于南海海域的养殖牡蛎，用小鼠生物（MBA）法和高效液相色谱（HPLC）法进行麻痹性贝类毒素检测。MBA毒性分析结果显示：8个区域养殖牡蛎的毒素含量为OM U/g-2.3MU/g，符合我国贝类食品安全限量要求;HPLC毒素成分分析结果显示：湛江、深圳、汕头、台山和阳江等5个海域的养殖牡蛎体内检测出痕量的麻痹性贝类毒素，湛江、深圳、汕头和阳江海域的养殖牡蛎中检出高毒性的STX和necSTX。本次麻痹性贝类毒素测试MBA法的检出率为2.5%，HPLC法的检出率为62.5%，HPLC法更适合于检测麻痹性贝类毒素含量低的样品。

关键词：南海海域：牡蛎：麻痹性贝类毒素

麻痹性贝类毒素（PSP）是一类剧毒的含氮杂环有机物，其基本化学结构是带两个胍基（=NH2）的嘌呤核，目前已经分离出24种毒素，研究得比较多的主要有以下三种类型： （1）氨基甲酸酯类毒素（Carbamoyl toxins），如石房蛤毒素（ saxitoxins，STX）、新石房蛤毒素（Neosaxitoxins，neoSTX）、膝沟藻毒素（Gonyautoxin，GTX l-4）; （2） N-磺酰胺甲酰基类毒素（N-sulfo carbamoyl toxins），如C1-4.GTX5（Bi）、GTX6（B2）; （3）脱氨甲酰基类毒素（Decarbamoyltoxins），包括dc STX. dc neo STX. dc GTX卜4等[1，2]，PSP的主化学结构如图1所示。在24种PSP中以氨基甲酸酯类毒素中的STX最为常见，是目前最主要的研究对象[3]。贝类毒素的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关。

PSP对人体有较大的毒性，其在贝类体内呈结合状态，因此贝类摄入此毒素对自身不会造成危害。当人摄入含PSP的食物后，毒素进入人体会迅速释放并呈现毒性，中毒的临床症状有轻微的麻刺感、呼吸麻木、窒息死亡[4]。牡蛎一般养殖在江河人海口或海湾内的浮游生物丰富、泥沙底的近岸滩涂，水深不大，所以牡蛎的PSP毒性检出率相对较高[5]。

一、实验材料、试剂与仪器

1.实验材料。牡蛎样品于2013年3月采集于钦州、北海、湛江、台山、深圳、汕尾、阳江和汕头等八个牡蛎养殖基地，总共有8组样品。牡蛎活体样品送至实验室后，用水冲洗外壳，用不锈钢刀将外壳打开取肉，清洗并沥干水分后匀浆，于-20℃条件下保存备用。

2.实验试剂。实验所使用的麻痹性贝类毒素标准系列：石房蛤毒素群（STX和neo- STX）和N-磺酰氨甲酰基类毒素群（CI和C2）均购于加拿大海洋生物研究所;20±29昆明系雄性小鼠，实验动物许可证号为SYXK2008-0010;乙酸、磷酸氢二钾、盐酸、乙腈、庚烷磺酸钠、C18固相萃取柱（ Waters）、柱后衍生液（70mmol/L高碘酸、0.1 2mol/L氢氧化钾和0.75mo1/L甲酸铵的20%甲酰胺，Ph7.3-7.5）和磷酸。

3.实验仪器。高效液相色谱仪LC-20AD（日本岛津）、RF-IOAXL荧光检测器、CRB-6A柱后衍生装置;色谱柱XB-C18 （4.6mm×150mm，Ultimate）;恒温水浴锅、离心机、固相萃取装置和涡旋混合器。

二、分析方法

1.小鼠生物（MBA）法。按GB/T5009.213-2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》用盐酸提取PSP毒素。取体重在20±29范围的昆明系雄性小鼠三只，称重并记录重量。将ImL盐酸提取液腹腔注射于小鼠，记录注射完毕时间和小鼠死亡时间。以体重209的昆明系雄性小鼠在腹腔注射后15min死亡的致死量为1个鼠单位（MU），根据麻痹性贝类毒素死亡时间 鼠单位（MU）关系表和小鼠体重校正表，计算PSP的毒力，检出限为2MU/。

2.高效液相色谱（HPLC）法。定量取小鼠生物法樣品的盐酸提取液，过C18固相萃取柱净化后，经高效液相色谱仪和在线柱后衍生，即HPLC的洗脱液与高碘酸等反应液反应生成荧光衍生物，用荧光检测器检测，外标法定量。

柱后衍生反应的条件：衍生液流速0.8min/mL，柱后衍生温度50℃，荧光检测器激发波长330nm，荧光波长390nm。流动相为2mmol/L庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液（pH7.1）：乙腈=96：4。

三、结果与分析

1.牡蛎中PSP的测定结果。本次试验首先用小鼠生物法（MBA）法检测采自钦州、北海、湛江、阳江、台山、深圳、汕尾和汕头等8个海域的牡蛎体内PSP毒性值，结果见表1、2。

从表2可得知，本次研究中的采样点钦州、北海、湛江、台山和汕尾的牡蛎中PSP毒性值均小于2MU/g（即未检出），而采自深圳和汕头的牡蛎均检出PSP，且毒性值都为2.3MU/g，未超出4MU/g的安全食用限值。2013年3月，南海海域的牡蛎中PSP检测结果显示该海域的牡蛎受到轻度污染，又以粤东一带海域是主要染毒区，钦州、北海、湛江、阳江、台山和汕尾等海域的牡蛎使用MBA法均未检出PSP。

由于MBA法敏感性差异较大，从而造成结果的波动性较大，为了防止MBA法出现假阴性结果，本次检测同时使用灵敏度较高的HPLC法对MBA法的毒素提取液进行毒素分析，从牡蛎中检测出毒性较低的C1和C2，中等毒性的dcSTX，以及毒性较强的neo STX和STX，结果见表2。

从表2可得知，本次钦州、北海和汕尾海域的牡蛎经HPLC分析均未检测出任何一种的毒素成分，而湛江、阳江、台山、深圳和汕头海域的牡蛎均检测出含有痕量的毒素，但因为色谱峰面积过小，无法进行准确的定量。湛江、阳江和台山海域的牡蛎在小鼠生物法中未能检测出PSP，但却从HPLC法中检测出含有极微量的STX，neoSTX和C2。

此结果显示，湛江、阳江和台山海域的海产品同样具有受到PSP污染的风险。钦州和北海的牡蛎在本次调查中均未检测出PSP，可能与该海域为开放式海域，海水自净能力较强有一定的关系。另据2005年卢楚谦等人在广西近岸海域作的PSP调查发现附近海域有贝类染毒，该海域贝类的染毒高峰期是在4-5月和7-11月[6]，本次调查的采样时间段并不在染毒高峰期内，因此该海域的贝类受PSP污染的风险不可忽视。

2.MBA法和HPLC法检测PSP结果分析。8组牡蛎样品在进行生物测试的同时也进行了HPLC方法的测试，MBA法带毒牡蛎检出率为25%，HPLC法带毒牡蛎检出率为62.5%，前法的检出率明显低于后法。台山海域的牡蛎在HPLC法中检测出1.12Ug/g的C.毒素，但在MBA法中却未检测出毒素，由于C2毒素的毒性较低，仅相当于STX毒性的13%，因此实验动物未出现中毒症状。

3.南海海域养殖牡蛎PSP安全性评价。我国对贝类食品中PSP最高限值的规定为4MU/g，本次PSP毒性调查中牡蛎的PSP毒性值在OMU/g-2.3MU/g，与黄海和渤海[7，8]等海域相比较，总体毒性值均低于我国食品安全限值。因此，食用南海海域养殖或者捕捞的贝类中毒的风险比较小，但必须保持谨慎的态度，不可过量食用。

4.不同海域间的PSP结果比较。本次调查牡蛎的采样范围东至汕头西至钦州，覆盖了整个南海海域，除了汕尾、钦州和北海海域的牡蛎未检测出PSP外，其余5个海域的牡蛎均有检测出PSP，结果说明湛江及其周边海域均遭到PSP不同程度的污染。PSP污染贝类具有一定的地域性，粤东海域PSP检出率和毒性值较其他海域的高，主要集中在深圳和汕头海域。在HPLC法检出的毒素种类中，80%都为高毒性的氨基甲酸酯类毒素（STX和neoSTX），这个结果与2001-2002年秋季吴施卫等人用HPLC法分析广东省近岸海域贝类时高毒性毒素STX、GTXI检出率较低、中低毒性毒素C1-2、GTX3-5检出率较高[9]的结果有差异。与前文献[10]相比较，高毒性的PSP毒素主要出现在秋冬季节，而本次调查的春季牡蛎体内高毒性的毒素却有高检出率，应当引起重视，这与周边海洋环境的恶化、产毒藻类的增加和有毒赤潮的发生不无关系，从另一侧面也反映了该海域贝类体内的毒素有增强的趋势。湛江海域的牡蛎虽在MBA法中没有检测出PSP，但在灵敏度更高的HPLC法中检测出含有痕量高毒性的STX，推测湛江海域存在着产毒的毒藻，从而使湛江海域海产品感染PSP的风险大增。

四、结论

近年来，我国针對贝类的质量安全做出了巨大的努力，麻痹性贝类毒素已经被列入贝类安全监控的常规检测指标，但因食用贝类中毒事件仍相继发生，本次检测分析暴露了我国海域麻痹性贝类毒素安全状况不容乐观。我国对PSP的研究起步较晚，相关研究和资源措施都非常缺乏，只有少数几个科研单位在做相关的研究工作。受毒素提取困难、检测方法灵敏度低、检测成本昂贵等因素的影响，一直以来对PSP的检测和监控难以广泛开展。为了防止因PSP引发的对外贸易质量安全问题的发生，保护消费者的生命健康，必须增加对麻痹性贝类毒素的研究工作，加强南海海域PSP的监控。

参考文献

[1]Y. Oshima，J. AOAC Int. 78（1995）：528.

[2]Mireia Lara Artigas， et al_Profiles of paralytic shellfishpoisoning toxins in shell6sh from Portugal explained bycarbamoylase activity [J]. Journal of Chromatography A，2007（1160）：99-105.

[3]林燕堂，贾晓平，杨美兰等.中国沿海染毒贝类的麻痹性毒素[J].热带海洋，1999，1（18）：1-2.

[4]蒋幼民，张连生，赵文彬等.麻痹性贝类毒素中毒的流行病学特征[J]现代预防医学，2004，31（5）：711-712.

[5]吴施卫，曾淼，等.2005年春季广东近岸海域麻痹性贝毒素的特征分析[J]海洋学研究，2008，26（4）：49-54.

[6]卢楚谦，吴施卫，等，广西近岸海域麻痹性贝类毒素分析[J]海洋环境科学，2005，24（3）：47-50.

[7]孔凡洲，徐子钧，于仁成，李钦亮，等.黄渤海海域贝类麻痹性贝毒的检测与分析[J]中国海洋大学学报.2007，37（2）： 305-309.

[8]张树刚，刘亚林，陈雷，邱进坤，等.淅南海域麻痹性贝毒研究[J] .2011，30（5）： 703-706.

[9]吴施卫，江天久，张纯超，等.广东省近岸海域麻痹性贝类毒素HPLC分析[J]海洋通报，2005，24（3）：48-55.

[10]吴施卫，陈凯彪，等.流沙湾养殖区的贝类毒素分析[J].海洋环境科学，2010，29（4）：531-534.