鸡胚营养组合物对衰老大鼠干细胞增殖的影响

马佳 吕鑫 胡家磊 单宇佳 贾莉

摘 要：目的：研究鸡胚营养组合物对衰老大鼠干细胞增殖的影响，探讨其延缓衰老的可能机制。方法：选取SD大鼠，随机分为正常对照组、衰老模型组、鸡胚营养组合物组、鸡胚组、营养组合物组和蛋清组，分别给予相应处理，留取大鼠肝脏、肾脏、肠和脑组织，采用免疫组化法检测衰老大鼠各组织干细胞增殖情况。结果：鸡胚营养组合物处理衰老大鼠后，大鼠肝脏、肾脏、肠和脑组织干细胞标志物的表达量显著升高。结论：鸡胚营养组合物在一定程度上可以促进衰老大鼠的干细胞增殖，此可能为其延缓衰老的作用机制之一。

关键词：衰老;鸡胚;营养组合物;干细胞

衰老又称为老化，是一种复杂的自然现象，涉及分子、细胞、组织和器官的变化[1]。干细胞作为一类多潜能细胞，能够在一定条件下分化成为胚胎干细胞、成体干细胞等多种细胞，为修复机体组织器官的损伤发挥重要作用[2]。然而，干细胞和其他成体细胞一样，随着年龄的增长，其自我更新能力和分化能力会逐渐衰退，甚至出现功能性障碍[3]。研究表明，干细胞衰老会导致机体组织器官再生能力下降、体细胞数量减少，加速机体衰老[4]。因此，探索延缓干细胞衰老的治疗措施是防止机体衰老的重要途径。本研究采用D-半乳糖的方法建立衰老大鼠模型，探讨鸡胚营养组合物对衰老大鼠各器官干细胞增殖的影响，为鸡胚营养组合物在抗衰老的临床治疗应用上提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

营养组合物由大连金斧公司提供，由赖氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸、牛磺酸、核苷酸、维生素C、维生素D、维生素B12、叶酸、钙、铁、锌、硒等52种物质组成，按原方比率配方，经水煎、超声、浓缩，配制成口服液，分装备用。

1.2 实验试剂

主要试剂：D-半乳糖（美国Sigma公司）兔抗大鼠CD90、CK19 抗体;兔抗大鼠CD133、OCT4抗体;兔抗大鼠Lgr5、Musashi-1抗体;兔抗大鼠Nestin、CD133抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）;羊抗兔二抗及SP免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 实验动物及实验流程

选取90只SD雄性大鼠，由大连医科大学动物实验中心提供。根据动物药理学的药品剂量和综合试验的设计分析，分为：（1）正常对照组;（2）衰老模型组;（3）鸡胚营养组合物组，以鸡胚（用量同鸡胚对照组）和营养组合物混合物进行灌胃;（4）鸡胚组，选取第3天胚龄的鸡蛋，每个鸡蛋取3mL鸡胚液，以1mL鸡胚液对大鼠进行灌胃;（5）营养组合物组，1～15d以0.381 6g/d 对大鼠进行灌胃，16～30d以0.763 2g/d 对大鼠进行灌胃，30～90d以1.144 8g/d 对大鼠进行灌胃;（6）蛋清组，选取未受精的鸡蛋，每个鸡蛋取3mL蛋清，以1mL蛋清液对大鼠进行灌胃（由于鸡胚组、营养组合物组皆含有氨基酸类，因此特设蛋清组）。

实验流程：除正常对照组外，其余各组每日颈背部皮下注射D-半乳糖500mg/kg，连续造模90d。同时，从建模第1天起，鸡胚营养组合物组、鸡胚组、营养组合物组、蛋清组，分别以相应剂量对大鼠进行灌胃，每天1次，直至第90天，颈椎脱臼处死大鼠，留取大鼠肝脏、肾脏、肠、脑组织标本进行后期检测。

1.4 实验方法

将大鼠部分肝脏、肾脏、肠、脑组织置于10%甲醛中固定，依次经过常规脱水、石蜡浸泡包埋、切片后进行组织化学染色。组织化学染色具体步骤：室温脱蜡，将玻片置于二甲苯中2次，10min/次;水化，将玻片依次置于100%、95%、85%、75%乙醇，3min/次;水冲10min，PBS洗片2～3次，3min/次;抗原修复，温度控制在92～95℃，玻片置于枸橼酸钠溶液中15min，最后自然冷却至室温;PBS洗片2～3次，3min/次;在玻片上滴加H2O2，避光静置10min;PBS洗2～3次，3min/次;滴加山羊血清封闭液，室温15min;滴加一抗50μL，4℃过夜;复温45min，PBS洗2～3次，3min/次;滴加二抗40～50μL，室温静置15min;PBS洗2～3次，3min/次;滴加链霉卵白素-过氧化物酶40～50μL，室温静置15min;PBS洗2～3次，3min/次;DAB顯色5min，自来水冲洗10min，苏木素染色30s，水冲10min;脱水、透明、封片、镜检。

1.5 统计学分析

所有数据均用SPSS 17.0软件进行统计分析。数值用均数±SD表示。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 鸡胚营养组合物对衰老大鼠肝脏干细胞的影响

与正常对照组相比，衰老模型组大鼠肝脏干细胞CK19的表达量显著减少（图1），鸡胚营养组合物处理衰老大鼠后，大鼠肝脏干细胞CK19的表达量显著增加;与衰老模型组相比，鸡胚组大鼠肝脏干细胞CK19的表达量明显增加，而营养组合物组和蛋清组大鼠肝脏干细胞CK19的表达量无明显变化。各组大鼠肝脏干细胞CD90的表达量无明显变化。以上结果表明，鸡胚营养组合物对衰老大鼠肝脏干细胞的增殖有一定作用。

2.2 鸡胚营养组合物对衰老大鼠肾脏干细胞的影响

与正常对照组相比，衰老模型组大鼠肾脏干细胞CD133、OCT4的表达量显著降低（图2），鸡胚营养组合物处理衰老大鼠后，大鼠肾脏干细胞CD133、OCT4的表达量明显增高;与衰老模型组相比，鸡胚组和营养组合物组大鼠肾脏干细胞CD133、OCT4的表达量增高，但其表达量低于鸡胚营养组合物组，而蛋清组大鼠CD133、OCT4的表达量无明显变化。以上结果表明，鸡胚营养组合物能够显著促进衰老大鼠肾脏干细胞的增殖。

2.3 鸡胚营养组合物对衰老大鼠肠道干细胞的影响01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1

与正常对照组相比，衰老模型组大鼠肠道干细胞Musashi-1、Lgr5的表达量显著降低（图3），鸡胚营养组合物处理衰老大鼠后，大鼠肠道干细胞Musashi-1、Lgr5的表达量明显增高;与衰老模型组相比，鸡胚组和营养组合物组大鼠肠道干细胞Musashi-1、Lgr5的表达量增高，而蛋清组大鼠肠道干细胞Musashi-1、Lgr5的表达量无明显变化。以上结果表明，鸡胚营养组合物能够显著促进衰老大鼠肠道黏膜干细胞的增殖。

2.4 鸡胚营养组合物对衰老大鼠神经干细胞的影响

与正常对照组相比，衰老模型组大鼠神经干细胞Nestin、CD133的表达量明显减少（图4），鸡胚营养组合物处理衰老大鼠后，大鼠神经干细胞Nestin、CD133的表达量明显增高;与衰老模型组相比，鸡胚组和营养组合物组大鼠神经干细胞Nestin、CD133的表达量增高，但其表达量低于鸡胚营养组合物组，而蛋清组大鼠神经干细胞Nestin、CD133的表达量无明显变化。以上结果表明，鸡胚营养组合物能够显著促进衰老大鼠神经干细胞的增殖。

3 讨论

目前研究认为，机体衰老和干细胞衰老的发生是相互关联的，如临床所见组织器官退行性病变、功能丧失、肿瘤发生和反复感染等衰老现象，均是机体干细胞增殖能力降低和功能衰退的反映[5]。而干细胞衰老学说是目前阐明机体衰老最新的学说。研究表明，营养组合物包含多种氨基酸、维生素、核苷酸等营养成分，能够有效改善骨髓造血微环境，促进小鼠造血干细胞增殖、分化[6]。鸡胚蛋作为民间药膳餐补食品，被学者广泛验证具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力以及补血养血的功能[7]。因此，探讨鸡胚营养组合物调节干细胞增殖能力对于延缓衰老、预防老年性疾病方面具有重要的临床应用价值。

CK19作为一种低分子角蛋白，其特异性表达于肝卵圆细胞表面，而卵圆细胞是目前公认的肝脏组织来源的干细胞，在肝细胞再生能力不足的情况下，特异性分化成肝细胞[8]。CD133和OCT4作为肾脏干细胞表面分子标记物，对维持干细胞的多能性以及修复肾小管损伤方面具有重要作用[9]。肠道干细胞是一类未分化的原始细胞，位于肠道隐窝的基底部，具有自我复制及分化的潜能[10]。Musashi-1和Lgr5是小肠干细胞的特异性表面分子标记物，对维持小肠的稳态发挥重要作用[11]。神经干细胞是一种具有向神经元和神经胶质细胞分化潜能的细胞[12]。Nestin和CD133作为神经干细胞标志物，能够促进细胞结构重构，修复神经损伤[13]。本实验显示，鸡胚营养组合物能够促进衰老大鼠肝脏干细胞、肾脏干细胞、肠粘膜干细胞和神经干细胞的增殖。

综上所述，鸡胚营养组合物可以有效提高衰老大鼠干细胞增殖能力，为其应用于临床延缓衰老的治疗提供科学依据。

参考文献

[1]王艳红，高江霞，孟敏，等.马栗籽提取物对D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影响[J].中国新药杂志，2017，26（2）：208-213.

[2]Nurkovic J S，Volarevic V，Lako M，et al.Aging of stem and progenitor cells：mechanisms，impact on the Therapeutic Potential and Rejuvenation[J].Rejuv Res，2015，19（1）：3-12.

[3]Conboy IM，Conboy MJ，Rebo J.Systemic problems：a perspective on stem cell aging and rejuvenation[J].Aging（Albany NY），2015，7（10）：754-765.

[4]張金生，张宝霞，朱慧芳，等.机体衰老、干细胞衰老与补肾化瘀生新[J].中医研究，2015，28（12）：1-3.

[5]丛秀丽.干细胞与机体衰老的研究进展[J].中国美容整形外科杂志，2017，28（5）：277-280.

[6]苗小艳，贾莉，杨佩满.营养组合物对再生障碍性贫血小鼠肝干细胞的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（13）：3536-3538.

[7]李曦.鸡胚蛋对免疫力低下小鼠的免疫调节功能研究[D].无锡：江南大学，2012.

[8]Hu A，Cai J，Zheng Q.et al.Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro[J].Chin Med J（Engl），2003，116（12）：1893-1897.

[9]Yousof G，Masoud S，Zeinali S，et al.Isolation of stem cells from adult rat kidneys[J].Biocell，2009，33（1）：33-38.

[10]王运星，吴承堂.肠道干细胞标记物的研究现状与进展[J].中国普通外科杂志，2008（10）：1013-1015.

[11]赵晔，李建生，马长路.胃肠道干细胞标记物的筛选[J].胃肠病学和肝病学杂志，2006（2）：199-202.

[12]陈汉想.神经干细胞相关研究进展[J].中国组织工程研究与临床康复，2007（28）：5580-5583.

[13]史冬梅，周畅，谢佐平.神经干细胞有丝分裂过程中nestin表达变化[J].神经解剖学杂志，2003（2）：119-123.

Effects of Chick Embryo and Nutrient Mixture on Proliferation of Stem Cells in Aging Rats01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1

MA Jia *，LV Xin *，HU Jia-lei，SHAN Yu-jia，JIA Li

（College of Laboratory Medicine，Dalian Medical University，Dalian 116044，China）

Abstract：Objective To study the effect of the chick embryo and nutrient mixture on the proliferation of stem cells in aging rats，and explore the mechanism of chick embryo and nutrient mixture in the treatment of aging rats.Method SD rats were randomly divided into six groups including control group，aging model group，chick embryo and nutrient mixture group，chick embryo group，nutrient mixture group and albumen group.After the corresponding treatment，immunohistochemistry staining was used to analyze the expression of liver，kidney，intestine and brain stem cell markers.Result After the aging rats treated with the combination of chick embryo and nutrient mixture，the expression of liver，kidney，stomach，intestine and brain stem cell markers were increased.Conclusion The combination of chick embryo and nutrient mixture promoted stem cells proliferation in aging rats.This might be a mechanism for the treatment of aging.

Keywords：aging;chick embryo;nutrient mixture;stem cell

（責任编辑 李婷婷）01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1