水稻OsPLATZ14基因启动子的克隆及表达分析

陈睿 陈建民 吴明基 杨绍华 胡昌泉

摘要：【目的】研究pOsPLATZl4的结构及时空表达模式，对深入研究OsPLATZl4基因功能、了解PLATZ转录因子在水稻生长发育进程的作用具有重要意义。【方法】利用BDGP、FPROM及Cister预测分析pOsPLATZl4大小，以水稻日本晴基因DNA为模板扩增pOsPLATZl4;应用PlantCARE分析序列中的顺序作用元件，构建pOsPLATZ14：：GUS载体，转化水稻获得转基因植株;通过GUs组织化学染色法分析pOsPLATZl4在水稻中的时空表达特征。【结果】经PCR扩增获得pOsPLATZl4长度为1899bp，该区域含有光信号、逆境响应及激素应答等多种顺式作用元件。pOsPLATZl4驱动的GUS报告基因在水稻种子萌发期，苗期根、茎、叶，抽穗期的根、茎、叶、花穗、小花、叶夹角、茎结合部位、根茎过渡区及成熟期种子均有明显表达。【结论】pOsPLATZl4为组成型启动子，其下游调控基因OsPLATZl4可能在水稻生长发育过程中起重要作用。

关键词：水稻;PLATZ转录因子;启动子pOsPLATZl4;表达分析;GUs活性

中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）10-1137-07

0引言

【研究意义】PLATZ（又称PLATZl，plant AT-rich sequence and zinc-binding protein 1）是一种新型植物特异性锌依赖的转录因子，在植物次生代谢、应激反应以及特定细胞类型的识别等特有的过程中发挥着重要作用。水稻作為单子叶植物模式植物及重要的粮食作物，拥有15个PLATZ基因（http：//PIntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/fam mem php？family id=PLATZ&sp id=OSAI），然而该类基因如何参与水稻生长发育的进程却知之甚少，研究PLATZ转录因子的功能及调控模式，加深了解该类基因的研究具有重要意义。【前人研究进展】PLATZ家族蛋白长度约82个氨基酸，包括C-X2-H-X11.C-X2-C-X（4-5）-C-X2-C-X（3-7）-H-X2-H和C-X2-C-X（10-11）-C-X3-c两个主要分区的保守PLATZ结构域，广泛分布于双子叶植物、单子叶植物、苔藓和藻类中。至今为止，仅有少数PLATZ基因的功能已知。PLATZ转录因子首次由Nagano等于2001年从豌豆中分离，非特异地结合到富含A/T序列且负向调控基因petE的增强子。Hyun-A等2015年从大豆中分离出AtPLATZl基因，亚细胞定位于细胞核且参与渗透胁迫条件下种子发芽过程。Gonzalez-Morales等2016年利用T-DNA插入敲除AtPLATZl和AtPLATZ2基因功能，证实这两基因的表达可提高种子干燥耐受性，在种子干燥耐受性中发挥重要作用。Li等2017年克隆和功能解析了FL3（ZmPLATZl2）基因，该基因在胚乳淀粉细胞中特异表达，与RNAPIII两个关键亚基RPC53和TFCl相互作用，参与tRNA和5s rRNA转录调控，从而调控胚乳发育和储存物质合成。Wang等2018年鉴定并克隆了玉米基因组中的17个PLATZ基因，所有ZmPLATZs均位于细胞核内，普遍参与了RNA聚合酶III（RNAPIII）介导的小分子非编码RNA转录的调控。Kim等2018年在拟南芥中克隆新AtPLATZ基因ORESARAl5，其通过促进早期细胞增殖的速度和持续时间来促进叶片生长，通过GRF/GIF调节通路来抑制后期叶片衰老。Wang等2019年图位克隆并功能鉴定了水稻中的第一个PLATZ基因GL6，该基因通过与rpc53和tfcl相互作用，参与RNA聚合酶III转录机制，促进幼穗和谷粒的细胞增殖，对谷粒长度起到积极的控制作用。【本研完切人点】截至目前，水稻尚有14个PLATZ基因功能未知。本文选取OsPLATZl4，从基因启动子的时空表达模式入手解析该基因的功能。启动子是转录水平调控的重要顺式作用元件，研究OsPLATZl4基因的结构及功能将有助于了解该基因在水稻生长发育的作用。【拟解决的关键问题】本研究通过构建OsPLATZl4启动子与GUS报告基因的融合表达载体pOsPLATZl4，利用农杆菌介导法转入野生型日本晴获得转基因植株。通过GUS组织化学染色分析该基因的时空表达特性，旨在为进一步研究OsPLATZl4在水稻生长与发育中的功能奠定基础。

2.4OsPLATZl4启动子在水稻中的表达特征

以日本晴为阴性对照，同时取10个Tn代阳性转基因株系及其收种后萌发进行GUS组织化学染色分析。分别取种子萌发期，苗期根、茎、叶，抽穗期的根、茎、叶、花穗、小花、叶夹角、茎结合部位、根茎过渡区及成熟期种子进行GUS染色，通过组织化学染色法分析OsPLATZ14启动子在水稻中的时空表达特征（图5）。结果显示种子的萌发期、幼苗的营养生长期及生殖生长期，转基因植株各部分

3讨论

基因功能分析是生物学热点研究内容。启动子是基因表达的重要顺式作用元件，研究启动子的结构及其时空表达模式，有助于了解其下游调控基因的表达模式及调控机制。近年来启动子分析成为开展基因功能研究的有效途径之一。启动子是位于基因5’端上游的DNA序列，目前主要采用生物信息学对目的片段进行预测，常用的分析预测软件如Primer-BLAST、Softberry系列工具、Promoter2.0、BDGP、Cister、Match及AliBaba 2.1等。如何截取合理的长度用于研究，需要综合多个预测软件结果。本研究利用BDGP、FPROM及Cister等3个预测平台分析OsPLATZl4基因启动子长度约1855bp，结合特异PCR引物扩增最终确定pOsPLATZl4长度为1899bp。

通过PlantCARE分析pOsPLATZl4结构，发现该片段中含有确保下游调控基因转录的RNAPII核心启动子元件TATA-box和CAAT-box之外，还包含多种与植物生长发育、节律调控、逆境胁迫及激素响应元件，其中响应光信号4类、逆境胁迫2类、激素响应5类，暗示该基因可能参与水稻的发育、代谢和对逆境胁迫响应等多种生理过程。pOsPLATZl4驱动的GUS基因的表达模式显示在水稻整个生长过程的各组织中具有较强驱动力，表明OsPLATZl4参与水稻的生长发育全过程。

Wang等鉴定了水稻和拟南芥中所有的PLATZ成员，并构建了玉米ZmPLATZ的最大似然系统发育树，分析显示OsPLATZl4与ZmPLATZ3和ZmPLATZ13同源性高，暗示可能对植物的生长发育具有共同的作用。通过酵母双杂交试验确定ZmPLATZ3与RNAPIII转录复合物中的两个关键因子RPC53和TFCl相结合，ZmPLATZl3与RNAPIII转录复合物中的关键因子TFCl相结合，表明ZmPLATZ3和ZmPLA.TZl3参与RNAPIII介导的转录调节。RNAPIII转录复合物负责小分子RNA的转录，包括tRNA、5s rRNA、7SLRNA、RNaseP和其他小非编码RNA，调控RNA和多种细胞发育过程的蛋白质合成。由此推测OsPLATZl4极有可能具有类似功能，在水稻的生长发育中发挥重要的作用。后续研究将利用CRISPR/CAS9及酵母双杂等技术研究该基因在水稻生长发育中的功能，以进一步了解PLATZ转录因子家族对水稻的调控机理。