糖肾宁对高糖诱导的足细胞损伤模型Rho/ROCK通路的影响

徐嘉一 高彦彬 邹大威 王晓磊 王涛 师一民 吴冰杰

摘要 目的：基于Rho/ROCK信号通路研究中药糖肾宁对高糖诱导足细胞损伤模型的影响。方法：高糖培养足细胞，以不同药物分组干预足细胞24 h，用罗丹明染色的鬼笔环肽法检测足细胞骨架，细胞免疫荧光检测足细胞标志蛋白Nephrin，Western Blotting检测RhoA、ROCK1、Nephrin蛋白的表达。比较不同药物或药物浓度对高糖诱导足细胞损伤模型的影响。结果：糖肾宁可改善足细胞骨架结构，下调高糖诱导的足细胞损伤模型中异常升高的RhoA和ROCK1蛋白表达，上调Nephrin表达。结论：中药糖肾宁可抑制高糖诱导的足细胞损伤模型RhoA/ROCK1信号通路，减轻足细胞骨架重构，改善足细胞损伤。

关键词 中药;糖肾宁;高糖;足细胞损伤;Rho/ROCK通路;实验研究;足细胞标志蛋白;糖尿病肾病

Effects of Tangshenning on High Glucose-Induced Podocyte Injury Based on Rho/ROCK Pathway

Xu Jiayi1，2， Gao Yanbin1，2， Zou Dawei1，2， Wang Xiaolei1，2， Wang Tao1，2， Shi Yimin1，2， Wu Bingjie1，2

（1 School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2 Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research， Beijing 100069， China）

Abstract Objective：To investigate the mechanism of traditional Chinese medicine Tangshenning on high glucose-induced podocyte injury based on Rho/ROCK signal pathway.Methods：Podocytes were cultured in high glucose.The podocytes were treated with different drugs for 24 h.The podocyte cytoskeleton was detected by rhodamine-stained phalloidin.The podocyte marker protein Nephrin was detected by immunofluorescence.Western blotting was used to detect RhoA， ROCK1 and Nephrin protein.Results：Tangshenning could improve the podocyte cytoskeleton， decreased expression of RhoA and ROCK1 protein， and increased expression of high glucose-induced Nephrin expression in high glucose-induced podocyte injury model.Conclusion：Traditional Chinese medicine Tangshenning can reduce the expression of RhoA/ROCK1 signaling pathway-related protein in high glucose cultured podocytes， reduce podocyte cytoskeletal remodeling， increase the expression of high glucose-induced Nephrin protein， and improve high glucose-induced podocyte injury.

Key Words Traditional Chinese medicine;Tangshenning; High glucose; Podocyte; Rho/ROCK signal pathway;Experimental study; Podocyte marker protein; Diabetic Nephropathy

中圖分类号：R242;R587.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.014

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是终末期肾病的最常见致病因素，在糖尿病患者中的发生率高达30%～40%，是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是糖尿病致死的主要因素。DN临床特征是进行性增加的蛋白尿，而足细胞功能障碍和形态学变化均可能导致肾小球滤过屏障功能受损，加重肾小球损伤，导致DN中蛋白尿的产生，足细胞损伤是糖尿病肾病肾小球损伤很关键的早期病理标记[1-3]。足细胞属于终末分化的细胞，由胞体、主突和足突构成。足细胞与毛细血管内皮细胞和肾小球基膜一起构成肾小球血液滤过屏障，故糖尿病肾病中足突的融合和消失、足细胞骨架蛋白的缺失、足细胞数量改变及裂孔隔膜蛋白异常都将导致足细胞损伤，进一步加剧肾损伤[4-7]。研究发现高糖可诱导足细胞的细胞骨架重排，使足细胞足突回缩、融合和消失，足细胞脱落，导致足细胞形态和功能改变，加剧肾小球损伤和蛋白尿的产生。临床实验证实中药糖肾宁在改善糖尿病肾病蛋白尿方面有非常显著的疗效[8]，而Rho/ROCK信号通路介导的细胞骨架重构作为治疗糖尿病肾病的关键通路，在改善足细胞损伤和蛋白尿方面至关重要[9]。本研究将通过Rho/ROCK通路，进一步探讨糖肾宁改善高糖诱导的足细胞损伤的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与动物 小鼠肾小球足细胞株购自北纳创联生物公司（批号：BNCC337685）;8周龄SPF级SD大鼠，雄性，30只，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可号：SCXK（京）2016-0006。伦理编号：AEEI-2017-039。

1.1.2 药物 糖肾宁（成分：黄芪、金樱子、大黄、川芎等，购自北京康仁堂药业有限公司），缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，生产批号：H20040217）。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM低糖培养基（Gibco，10567014）;0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，25200056）;胎牛血清（依科赛，FSP500）;Nephrin抗体（Novus）;RhoA抗体（proteintech）;ROCK1抗体（proteintech）;罗丹明-鬼笔环肽（AAT）;甘露醇（Sigma）、葡萄糖（Sigma）。电泳仪和湿转装置（Bio-Rad，美国）;凝胶化学发光成像分析系统（VILBER LOURMAT，法国）;正置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜（Leica，德国）;多功能基因蛋白检测仪（SpectraMax iD3，奥地利）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备 选取SPF级SD雄性大鼠30只，适应性喂养3 d后，随机分空白组和糖肾宁组，糖肾宁组予中药糖肾宁[20 g/（kg·d）]，空白组予生理盐水，灌胃1次/d（2.25 mL/250 g），连续灌7 d。末次灌胃1 h后经腹主动脉取血，将采集的血液放在4 ℃中静置过夜，以3 000 r/min，离心15 min，收集上清液，56 ℃水浴30 min灭活，经0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装，置于-80 ℃保存备用。

1.2.2 细胞培养 取对数生长期的细胞，用胰酶消化细胞，待细胞变圆回缩后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，收集细胞，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加含10%胎牛血清的DMEM培养基5 mL于培养瓶中，置于5%CO2 33 ℃培养箱中增殖，每2 d换液，待细胞贴壁长至铺满培养瓶80%左右，1∶3传代。取第4～5代细胞，放置在5%CO2 37 ℃培养箱中培养7～14 d后，足细胞分化成熟，将分化成熟的足细胞在无血清的低糖DMEM培养基中孵育24 h，进行不同分组的干预24 h。实验分组为：正常组（NG，L-DMEM培养基+10%空白鼠血清）;甘露醇组（MG，L-DMEM培养基+24.5 mmol/L甘露醇+10%空白鼠血清）;模型组（HG，30 mmol/L葡萄糖的培养基+10%空白鼠血清）;糖肾宁低浓度组（LT，30 mmol/L葡萄糖的培养基+0.4%含药血清+9.6%空白鼠血清）;糖肾宁中浓度组（MT，30 mmol/L葡萄糖的培养基+2%含药血清+8%空白鼠血清）;糖肾宁高浓度组（HT，30 mmol/L葡萄糖的培养基+10%含药血清）;缬沙坦组（XST，30 mmol/L葡萄糖的培养基+1 μmol/L缬沙坦+10%空白鼠血清）。

1.2.3 检测方法

1.2.3.1 罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞骨架 按实验分组干预足细胞24 h，吸弃旧培养基，加入4%多聚甲醛溶液，常温固定20 min，再加入PBS溶液稀释的0.1%rtonX-100孵育10 min，分别加入100 μg/mL的罗丹明-鬼笔环肽工作液，锡纸覆盖，常温孵育1 h，再往每孔中滴加适量DAPI染液，孵育5 min，用抗荧光淬灭封片剂封于载玻片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.2.3.2 细胞免疫荧光检测 按实验分组干预足细胞24 h，用4%多聚甲醛溶液，室温下固定15 min，再加入PBS溶液稀释的0.5%Triton X-100，室温孵育20 min后，向各孔中加入适量的10%正常山羊血清，常温孵育30 min;吸水纸吸弃封闭山羊血清，不洗，加入稀释好的一抗，放入湿盒，4 ℃孵育过夜，次日将一抗弃掉，滴加稀释好的荧光二抗，放入湿盒，于37 ℃孵育1 h后，往各孔中滴加DAPI工作液，避光孵育10 min，用抗荧光淬灭封片剂封于载玻片，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.3.3 Western Blot检测 取分组干预后的细胞，加入适量的裂解液，提取细胞总蛋白，BCA测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，100 ℃金属浴加热10 min变性。吸取20 μg蛋白经电泳分离后转膜至0.45 μm PVDF膜，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，第2天TBST洗膜后加入相应的二抗，室温震荡1 h，TBST洗膜后加入现配置的ECL发光液，凝胶化学发光成像仪曝光，分析各蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS Statistics 21统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用百分比（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖肾宁对高糖诱导的足细胞损伤模型细胞骨架结构的影响 共聚焦显微镜观察足细胞骨架显示：NG组细胞骨架沿細胞长轴呈线性分布，骨架结构整齐清晰，足突明显，荧光强度明亮。MG组与NG组相似。而HG组细胞皱缩，骨架结构断裂，排列紊乱，荧光强度较NG组表达明显暗淡。而LT、MT、HT组细胞骨架结构均明显改善，荧光强度介于NG组和HG组之间，尤其HT组细胞骨架结构清晰，荧光强度较亮，足突明显，而XST组细胞骨架荧光强度亮，骨架结构清楚，但足突不明显。见图1。

2.2 糖腎宁对高糖诱导的足细胞损伤模型Rho/ROCK信号通路的影响 Western blot结果显示，MG组RhoA蛋白表达较NG组差异无统计学意义，HG组RhoA蛋白表达较NG组明显升高（*P<0.05），而LT、MT、HT组和XST组RhoA蛋白表达较HG组明显降低（△P<0.05），且LT、MT、HT组呈剂量依赖性下调异常升高的RhoA蛋白表达。MG组ROCK1蛋白表达与NG组比较差异无统计学意义（P>0.05），HG组ROCK1蛋白表达较NG组明显升高（*P<0.05），而LT、MT、HT组和XST组ROCK1蛋白表达较HG组显著降低（△P<0.05），且LT、MT、HT组呈剂量依赖性下调异常升高的ROCK1蛋白表达。见图2。

2.3 糖肾宁对高糖诱导的足细胞损伤模型Nephrin蛋白表达的影响 Western blot结果显示，MG组Nephrin蛋白表达与NG组比较差异无统计学意义（P>0.05），HG组Nephrin蛋白表达较NG组明显降低（*P<0.05），而LT、MT、HT组和XST组Nephrin蛋白表达较HG组明显升高（△P<0.05），且LT、MT、HT组呈剂量依赖性上调Nephrin表达。如图3，细胞免疫荧光显示，足细胞Nephrin蛋白主要在细胞质中表达，呈颗粒或线装分布，NG组和MG组表达差异无统计学意义（P>0.05），HG组Nephrin蛋白表达量少，LT、MT、HT组Nephrin蛋白表达较HG组有明显改善，其中HT组的荧光强度改善最为显著，XST组Nephrin蛋白表达较HG组有明显改善，蛋白表达趋势与Western blot结果一致。见图3。

3 讨论

中医认为糖尿病肾病是“消渴病”迁延日久，病久入络，继发于肾的肾络受损疾病，故称为“消渴病肾病”，国内学者多认为本病是以气阴两虚为本，痰湿、瘀血、浊毒等为标的虚实夹杂之证。高彦彬教授认为肾络病变是贯穿糖尿病肾病始终的病理基础，病变早期，肾气不固，肾络瘀滞;病变中期，阴损及阳，脾肾虚衰，肾络瘀阻;病变晚期，肾络瘀结，肾体劳衰。针对DN早期肾气不固、肾络瘀滞的病机特点，采用益气固肾，化瘀通络法获得较好疗效。临床研究表明糖肾宁可降低早期糖尿病肾病患者血糖、血脂水平，改善血液流变学，抑制血小板聚集，降低早期DN患者异常升高的肌酐清除率，显著减少微量蛋白尿，改善肾功能[8]。实验研究证实糖肾宁可上调糖尿病大鼠降低的足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin，下调异常升高的足细胞骨架蛋白Desmin的表达，减少糖尿病肾病大鼠足细胞损伤，降低蛋白尿，保护肾功能[10]。

足细胞即肾小球上皮细胞，相邻足细胞的足突互相交叉呈指嵌状形成的裂孔隔膜，与肾小球基底膜和内皮细胞组成肾小球滤过屏障。足细胞属于终末分化的细胞，在成人肾小球中进行细胞分裂的能力有限，足细胞肥大、足突融合、足细胞数量和密度降低、足细胞转分化和足细胞凋亡等细胞结构和功能异常均会导致足细胞损伤，使足细胞功能丧失，滤过膜通透性增加，进而导致肾小球滤过屏障受损，发生蛋白尿。因此，足细胞损伤被认为是各种肾小球疾病的关键发病机制[11-14]。而足细胞具有复杂的肌动蛋白细胞骨架结构，足细胞损伤与足细胞骨架结构的稳定密切相关，细胞骨架的动态调节对裂孔隔膜和肾小球滤过屏障至关重要，足细胞骨架失调将直接影响足突，导致足细胞足突回缩、融合、消失[15]。本研究发现，与正常组比较，模型组足细胞足突消失，细胞骨架结构回缩、断裂，排列紊乱，Nephrin蛋白表达显著降低，而糖肾宁可改善高糖诱导的足细胞损伤模型的细胞骨架结构重构，上调Nephrin蛋白表达，改善足细胞损伤。

RhoA GTP酶属于Ras超家族，是一类小GTP酶，可通过结合GDP和GTP起到分子开关的作用，Rho与GTP结合后，可激活下游Rho相关激酶（ROCK1）发生多个氨基酸位点的磷酸化。ROCK1是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶，起到调节肌动球蛋白细胞骨架的作用。RhoA激活后，将活化ROCK1，并介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应，增强肌动-肌球蛋白收缩，通过控制肌动蛋白丝稳定、肌动蛋白网络和肌动蛋白纤维组装，诱导细胞骨架重构[16-20]。本研究发现，与正常组比较，模型组RhoA和ROCK1蛋白表达水平明显升高，中药糖肾宁可下调异常升高的RhoA和ROCK1蛋白表达水平，提示糖肾宁可通过抑制RhoA/ROCK1信号通路蛋白表达，稳定足细胞骨架调节，改善足细胞损伤。

综上所述，本研究证实高糖可诱导足细胞Rho/ROCK信号通路激活，进而促进肌动蛋白收缩，以及细胞骨架重构，最终导致足细胞足突融合、消失等足细胞损伤。中药糖肾宁可下调异常升高的RhoA、ROCK1蛋白表达，稳定足细胞骨架结构，上调Nephrin蛋白表达，减轻高糖诱导的足细胞损伤。我们认为糖肾宁减轻足细胞损伤的作用可能与抑制Rho/ROCK通路，减轻细胞骨架结构损伤有关，其具体作用机制仍需进一步开展深入研究。

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（2019-06-28收稿 责任编辑：王杨）