沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌活性

杨 阳　郎文凯　杨 茂　刘文英

[摘要]随着时代发展与社会进步，细菌从被发现到现在已经与人们的生活息息相关，怎样抑制一些细菌的生长成为人们关注的问题。本实验以沙棘叶为原料，通过乙醇提取，再经过多级萃取，然后使用平板涂布菌种的方法探究沙棘叶正丁醇萃取物对三种细菌的抑菌效果。结果表明，沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的确具有抑制效果。

[关键词]沙棘叶;正丁醇;抑菌活性

中图分类号：Q946.91 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201912

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名醋柳、酸刺，胡颓子科沙棘属，是西藏本地医生、蒙古本地医生习用药材。沙棘可以在许多恶劣的条件下生存，是防风暴、固定沙土、防止水土流失、保护生态环境价值最高的树种[1]。

有研究表明，沙棘叶黄铜提取物对人体的皮下组织具有抗炎作用[2]，对于促进伤口的愈合，治疗炎症与烫伤等有很好的效果[3]。沙棘果实营养丰富，据测定，其果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮等活性物质和人体所需的各种氨基酸[4]。近年研究还表明沙棘黄酮具有抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、抗心律失常、增强机体免疫力、提高耐缺氧能力等药理功效[5-6]，且沙棘果多糖具有明显的抗氧化活性，抗氧化作用随浓度增加而加大[7]。

本文开展了沙棘叶抑制细菌生长的实验研究，对进一步了解沙棘叶的抑菌机理以及今后开发利用沙棘以及沙棘叶等沙棘相关产品提供了理论依据。

1 试验概述

1.1 主要仪器和设备

恒温培养箱：北京恒奥德科技有限公司;电子秤：厦门雄发仪器仪表有限公司;高压蒸汽灭菌锅：山东博科生物产业有限公司;超净工作台：南京贝登电子商务有限公司;恒温水浴锅：苏州江东精密仪器有限公司;分液漏斗、旋转蒸发仪：上海科兴仪器有限公司;电磁炉：美的集团有限公司。

1.2 菌种

大同大学生命科学学院提供的菌种为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）。

1.3 主要药品

95% 乙醇、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯。

1.4 培养基

1.4.1 牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15～25g，加水1 000mL，调pH到7.4～7.6。

1.4.2 液体培养基

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，调pH到7.2～7.5。

1.5 沙棘材料

沙棘采用的是中国沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），沙棘叶购买于山西五台山沙棘制品有限公司，为确保数量可以完成实验，购买500g。

1.6 沙棘叶正丁醇萃取物的制备

沙棘叶正丁醇萃取流程图，见图1。

1.6.1 沙棘叶粉碎

沙棘叶放入粉碎机中粉碎后取出筛选，将体积大的叶片加入粉碎机进行二次粉碎，将两次结果合并，干燥保存备用。

1.6.2 沙棘叶粉末乙醇浸提

取100g沙棘叶粉末分别加入1L烧杯中，共4个烧杯，再分别加入1L 95%乙醇，拿玻璃棒轻微搅拌后放入4℃冰箱5h，取出后经过滤得到滤液，保存备用。再取滤渣分别放入4个1L烧杯中，重复上述步骤，弃去滤渣，将所有滤液合并。

1.6.3 减压浓缩

启动旋转蒸发仪的冷凝装置，打开水浴锅，调节温度为45℃，安装回收溶剂瓶，然后打开真空泵里边的循环水，再打开开关，将旋转蒸发仪的放气活塞关闭并将沙棘叶乙醇提取液加入旋转瓶。当整个系统达到一定的真空度时，打开旋转按钮并调节转速。等旋转蒸发结束后，得到浸膏，保存备用。

1.6.4 石油醚萃取

将上一步得到的浸膏放入烧杯中，加入部分蒸馏水搅拌使其完全溶解。再加入3倍上步蒸馏水体积的石油醚，一起加入已經经过检漏的分液漏斗中，将其摇晃充分后，将分液漏斗固定并等待其中的液体静止分层，之后将水层和石油醚萃取液分离。按照上述过程操作3次，合并本步骤所有的萃取液，将其室温条件密封保存备用。

1.6.5 乙酸乙酯萃取

将上一步得到的蒸馏水溶液再加入分液漏斗中，用3倍体积乙酸乙酯来与其混合，然后用上一步的萃取操作重复3次萃取，之后合并所有乙酸乙酯的萃取液。

1.6.6 正丁醇萃取

将上一步蒸馏水溶液加入分液漏斗，同样加入3倍正丁醇和蒸馏水层充分混合，再用上一步萃取的操作重复3次萃取，最后合并所有的萃取液，将其保存备用。

1.6.7 减压浓缩

将石油醚萃取液放入旋转蒸发瓶中，通过操作成为浸膏。然后将乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液用同样的操作达到浸膏，再放入冰箱冷冻干燥，于-20℃冰箱中保存备用。

1.7 抑菌实验

1.7.1 菌株活化

在超净工作台内用无菌接种环将试验菌种接到做好标签标记的斜面培养基上，然后把细菌置于恒温培养箱内，温度设置为36℃，时间为22h，最后放入0℃～4℃冰箱冷藏，准备接下来步骤使用。

1.7.2 培养基平板的配制

将配置好的培养基倒入锥形瓶中，使用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌后取出，放进超净工作台。放好之后等待培养基凝固，为防止污染，需将平板倒置。最后将所有平板摆放整齐，在无菌条件下保存。

1.7.3 菌悬液的配制

在无菌的操作条件下，取出活化培养好的菌，用接种环分别挑取三种菌，分别接入经过高压蒸汽灭菌的无菌水中，轻微震荡使其均匀。然后用麦氏比浊法测菌悬液浓度，通过加入无菌水等方法控制菌悬液中的细菌数为1×108～2×108个/mL。

1.7.4 沙棘叶正丁醇提取液的配制

将沙棘叶正丁醇萃取物用电子秤称量0.5g、1.0g、1.5g、2.0g，将其分别放入小试管后再分别加入1mL正丁醇，搅拌摇晃使其溶解。

1.7.5 用滤纸片法测定沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌效果

首先在滤纸上画好半径3mm的圈，再用剪刀把滤纸剪成直径为6mm的小圆片，分别放置于小试管内，用报纸包裹，并将其扎紧。准备好后，进行灭菌。将灭菌后的滤纸片放在超净工作台中，分别放入之前准备好的无菌水与提取液中，浸泡放置，以备后用。然后使用移液枪分别取300μL三种菌悬液。用无菌涂布器均匀涂布，用无菌的镊子，分别镊取不同浓度滤纸片，轻轻地贴在前几步制好的平板。同时把对照组的纸片也贴在平板上。每个含菌平板上间隔一定距离贴5片，具体纸片间距大于20mm，纸片与培养皿壁间距超过12mm。通过培养后测抑菌圈直径。

1.8 数据分析

所有的实验均重复3次，之后利用Excel 2003进行标准曲线的绘制与数据分析。

2 结果与讨论

2.1 沙棘叶正丁醇萃取结果

沙棘叶萃取结果，见图2。

2.2 沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌作用

2.2.1 沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌的抑制效果

通过观察培养基，可以看出阴性对照组的抑菌圈几乎没有，而其余经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片，均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为0.5g/mL和1.0g/mL的纸片抑菌圈小一点，2g/mL的纸片抑菌效果最好（见表1），抑菌圈周围出现不同程度向周围扩散的无菌区域，由此可知，沙棘叶正丁醇萃取物可以抑制大肠杆菌的生长且抑菌效果较为明显。

2.2.2 沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果

观察培养基，可以看到经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为1.0g/mL的纸片抑菌圈小一点，达到了9mm，萃取液浓度是2g/mL的纸片抑菌效果较好，达到了11mm（见表2）。

其中抑菌圈周围出现不同程度向周围扩散的无菌区域，而相对于没有萃取物浸泡的纸片，并不存在抑制效果。因此，沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的生长确实存在抑制效果。并且由于抑菌圈较大，因此可以认为效果较好。

2.2.3 沙棘叶正丁醇萃取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果

观察培养基，可以看出阴性对照组抑菌圈没有，而其余几组经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片，在培养基上均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为0.5g/mL的抑菌圈为8mm，萃取液浓度为1.0g/mL的纸片抑菌圈为9mm，萃取液浓度为2g/mL的纸片抑菌效果最好，达到了12mm（见表3），其中抑菌圈周围出现不同程度的向周围扩散的无菌区域，沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌的生长确实存在抑制效果，并且由于萃取物成分复杂，且一定范围内，抑菌效果随萃取物的浓度变化而变化，因此浓度越高抑菌效果就越好。

2.3 抑菌实验结果及分析

根据实验结果可知，沙棘叶正丁醇萃取物对三种试验菌都存在不同程度的抑制作用，并且抑制效果非常明显。在一定范围内，抑菌效果随萃取物的浓度而变化，浓度越高抑菌效果就越好。

本文对沙棘叶进行较为常规的提取萃取，从中提取部分有效成分，并对其抑菌活性做了研究。本次研究的初步成果可以作为食品保鲜防腐的技术参考，沙棘叶正丁醇萃取物可以有效抑制有害菌的生长，也有利于沙棘叶资源的综合利用。

关于萃取物抑菌效果，刘世旺等[8]将不同浓度虎耳草乙醇提取物对三种实验菌进行抑菌实验。其实验结果与本实验对照比较来看，沙棘叶正丁醇萃取物与虎耳草乙醇提取物对三种菌的抑菌效果相差无几，并且沙棘叶正丁醇萃取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较虎耳草乙醇提取物强。

在萃取物应用方面，因为食品中常常含有本次实验的三种试验菌，其均为对人体有害菌，很有可能会引起食物中毒，甚至可能会导致死亡。故而，沙棘叶正丁醇萃取物可以当作一种很好的食品保鲜防腐剂。

就沙棘叶今后的发展来说，因为沙棘叶中含有的多种活性成分，除了有抑菌作用，还有许多药理作用。沙棘叶黄酮能有效地清除超氧阴离子和羟自由基，并且随着黄酮提取液浓度的增大，清除率逐渐上升。不仅如此，沙棘叶还有许多的活性物质并拥有不同的药用价值。所以，沙棘叶中含有的活性成分是今后研究的内容与方向。

实验还存在不足之处，沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌作用原理复杂，本文只是初探抑菌效果，为了保证充分地利用沙棘叶资源，对其抑菌的特点以及机理还需要进一步深入研究。

3 结 论

本实验以沙棘叶为原料，采用乙醇浸提，然后进行多级萃取，得到沙棘叶正丁醇萃取液11.1g，分别以革兰氏阳性菌中两个较为常见的菌：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌中较为常见的大肠杆菌为试验菌种，通过抑菌圈来评价沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌效果。结果表明，萃取液对三种菌均出現不同程度的抑菌效果。沙棘叶正丁醇萃取物对革兰氏阳性菌抑制明显且对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最好，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌相对来说较差，说明沙棘叶的正丁醇萃取物对革兰氏阳性菌抑制十分明显。经过学者研究，原因很有可能是沙棘叶中有效的抗菌活性物质含量比较高。并且沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌也出现了十分明显的抑菌圈，由此可见，正丁醇萃取物对（下转第页）（上接第页）三种试验菌均有抑制效果。

参考文献

[1] 郭云龙.围场沙棘资源开发利用设想[J].防护林科技，2007（S1）： 51-52.

[2] 梁艳文，孙贺，何罗香，等.玉米须纯化黄酮抗炎作用及急性毒性实验[J].吉林化工学院学报，2016，33（7）：13-16.

[3] 张新军，章茂顺，高志芬，等.醋柳黄酮对原发性高血压患者交感神经兴奋性的影响[J].华西医科大学学报，2001（4）：547-550

[4] 李晓花，孔令学，刘洪章.沙棘有效成分研究进展[J].吉林农业大学学报，2007（2）：162-167.

[5] 房兴莉，晋津，晋坤贞.沙棘叶的营养成分及其饮料开发[J].农牧产品开发，1996（11）：15-16.

[6] 张郁松，罗仓学.沙棘资源开发与沙棘黄酮提取[J].食品研究与开发，2005（3）：46-47.

[7] 刘春兰，杨万政，刘海青，等.沙棘叶水溶性多糖的初步纯化及体外清除自由基活性研究[J].内蒙古大学学报（自然科学版）， 2007（1）：35-38.

[8] 刘世旺，徐艳霞.虎耳草乙醇提取物抑菌作用的研究[J].资源开发与市场，2007（6）：481-482+489.

收稿日期：2019-10-23

作者简介：杨阳，男，博士，讲师，研究方向为天然产物营养与抗菌。