赪桐提取物抗菌活性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌机理

罗泽萍　潘立卫　李丽

摘要：【目的】揭示赪桐提取物（Extracts from Clerodendrum japonicum，EFC）對金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌机理，为临床抗病原菌感染药及植物杀菌剂的研发提供理论依据。【方法】采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌对EFC的敏感性，明确EFC的抗菌活性;通过试剂盒、流式细胞仪及扫描电镜等测定EFC作用后金黄色葡萄球菌细胞膜、细胞壁、三羧酸（TCA）循环、可溶性蛋白、胞内活性氧（ROS）水平、细胞凋亡及形态结构的变化，研究EFC的抗菌机理。【结果】EFC对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌3种供试细菌均具有抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强，其抑菌圈（IZ）、最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL。经EFC作用10 h后，金黄色葡萄球菌的乳酸脱氢酶（LDH）、钾离子（K+）及碱性磷酸酶（AKP）外泄分别显著增加72.0%、43.0%和78.0%（P<0.05，下同），琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）活性分别显著下降80.0%和36.4%。金黄色葡萄球菌经EFC作用24 h后，与对照组相比，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）组的胞外蛋白含量分别上升28.6%、41.8%和61.5%，胞内蛋白含量分别下降40.9%、61.3%和82.5%，胞内ROS水平分别增加9.1%、33.5%和51.0%，细胞凋亡率分别增加24.0%、50.6%和72.8%。经EFC作用24 h后，扫描电镜下的菌体形态结构不规则、萎缩、畸形。【结论】EFC通过破坏金黄色葡萄球菌细胞壁和细胞膜的完整性及通透性，影响蛋白合成，导致TCA循环减慢而发挥抑菌作用。

关键词： 赪桐;提取物;金黄色葡萄球菌;抑菌机理

中图分类号： S853.75                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2778-09

Antimicrobial activity of extracts from Clerodendrum japonicum and its antibacterial mechanism on Staphylococcus aureus

LUO Ze-ping1， PAN Li-wei1， LI Li2*

（1College of Chemical and Biological Engineering， Hechi University， Hechi， Guangxi  546300， China;

2College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning  530200，  China）

Abstract：【Objective】To reveal the antibacterial mechanism of extracts from Clerodendrum japonicum （EFC） against Staphylococcus aureus， and to provide a theoretical foundation for the research and development of clinical anti-pathogenic bacteria infection drugs and plant fungicides. 【Method】The sensitivity of S. aureus， Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis to EFC was determined by disk diffusion method and microbroth dilution method， and the antibacterial activity of EFC was determined. The changes of cytomembrane， cytoderm， tricarboxylic acid （TCA） cycle， soluble protein， intracellular reactive oxygen species（ROS） level， apoptosis and morphological structure of S. aureus treated with EFC were determined by kit， flow cytometry and scanning electron microscope to study the antibacterial mechanism of EFC. 【Result】EFC had antibacterial activity against S. aureus， S. typhimurium and B. subtilis， among which the antibacterial activity against S. aureus was the strongest， and its bacteriostatic zone（IZ）， minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） were 19.04 mm， 0.50 mg/mL and 1.00 mg/mL， respectively. After 10 h of treatment with EFC， the leakage of lactate dehydrogenase（LDH）， potassium ion（K+） and alkaline phosphatase（AKP） of S. aureus increased significantly by 72.0%， 43.0% and 78.0%， respectively（P<0.05， the same below）. The activities of succinate dehydrogenase（SDH） and malate dehydrogenase（MDH） decreased significantly by 80.0% and 36.4%， respectively. After S. aureus was treated with EFC for 24 h， compared with the control group， the extracellular protein content of 5 MIC， 10 MIC and 20 MIC groups increased by 28.6%， 41.8% and 61.5%， respectively， while the intracellular protein content decreased by 40.9%， 61.3% and 82.5%， respectively. The intracellular ROS level increased by 9.1%， 33.5% and 51.0%， and the apoptosis rate increased by 24.0%， 50.6% and 72.8%， respectively. After 24 h of treatment with EFC， the morphology and structure of the bacteria were irregular， atrophied and deformed under scanning electron microscope. 【Conclusion】By destroying the completeness and permeability of the cytoderm and cytomembrane of S. aureus， EFC affecting protein synthesis which leads to the slowdown of TCA circulation and hence plays a role in antibacterial action. Therefore， strengthening the research on the antibacterial components of EFC is an important way to develop new， efficient and low-toxic anti-pathogenic drugs and plant fungicides.

Key words： Clerodendrum japonicum; extracts; Staphylococcus aureus; antibacterial mechanisms

0 引言

【研究意义】使用抗生素是临床治疗传染性疾病的主要手段，但随着抗生素的大量及不合理应用，耐药细菌不断出现，超级耐药菌也随之产生（Deng et al.，2015），而如何应对多重耐药菌带来的危害已成为当前医学界广泛关注的重要课题之一。中药作为我国医学的宝贵遗产，具有独特的资源优势，且毒副作用小、不易产生抗药性（杨健等，2016;朴喜航和艾红佳，2017），推测利用中药及其有效成分控制细菌感染及降低细菌耐药性具有广阔的应用前景。因此，研究并开发中药抗菌制剂对避免耐药菌株的产生具有重要意义。【前人研究进展】赪桐（Clerodendrum japonicum）为马鞭草科（Verbenaceae）大青属（Clerodendrum）植物，该属植物因具有丰富的化学成分及独特的药理活性而受到广泛关注。田军和孙汉董（1995）应用正反相硅胶柱层析、中压柱层析及制备性薄层层析等手段，从赪桐中分离得到4个苯丙素苷类成分，同时获得22，23-二氢菠甾醇、豆甾醇、25，26-去氢豆甾醇、乌索酸、丁二酸酐和小麦黄素等化合物。尚冀宁（2010）对赪桐乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4个萃取部分的化学成分进行分离，结果鉴定出17种化合物，分别属于二萜、黄酮、甾体和香豆素等类型。陈俊等（2013）采用二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加及小鼠棉球肉芽肿等急慢性炎症模型，结果发现赪桐根水提物对急慢性炎症有明显的抗炎作用。焦杨等（2016）采用细胞溶血法研究赪桐醇提取物经典途径和旁路途径的抗补体活性，结果发现其具有较强的经典途径抗补体活性。张树琳（2018）利用系统溶剂法、正反相硅胶色谱和制备型HPLC等方法从赪桐乙醇提取物的乙酸乙酯中分离获得35种化合物，其中化合物Japonicum cyclic pentapeptide A、Japonicum cyclic pentapeptide B、Hydroxyhomodestru-xin B及Hydroxydestruxin B具有抗肿瘤活性。目前，关于赪桐抗菌活性的研究甚少，但已有大量研究表明同属植物臭牡丹、苦郎树和大青叶等均具有抑菌活性。臭牡丹提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌和大肠埃希菌等均有较强的抑制作用（刘建新等，2015）;苦郎树叶提取化合物（KLS-46和KLS-54）对西瓜枯萎病菌、芒果叶枯病菌、甘蔗凤梨病菌等植物病原真菌有明显抑菌活性（邓业成等，2012）;大青叶粗黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌具有明显抑制作用（刘富康等，2018）。【本研究切入点】赪桐在广西的资源非常丰富，但在临床上的应用并不广泛，通常作为可供观赏的园艺栽培植物，其药理作用及机制尚缺乏系统研究。【拟解决的关键问题】测定赪桐提取物（Extracts from C. japonicum，EFC）对金黄色葡萄球菌细胞膜、细胞壁、三羧酸（TCA）循环、可溶性蛋白、胞内活性氧（ROS）水平、细胞凋亡及形态结构的影响，揭示其抗菌机理，为临床抗病原菌感染药及植物杀菌剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料为赪桐的新鲜茎叶，母株采自广西河池市宜州区小龙村。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、伤寒杆菌（ATCC13311）和枯草芽孢杆菌（ATCC9372）由河池学院化学与生物工程学院制药工程实验室保藏提供。活性氧检测试剂盒（批号S0033）购自碧云天生物技术研究所;钾离子（K+）测定试剂盒（批号2018003）购自长春汇力生物技术有限公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号20171212）购自江苏凯基生物技术股份有限公司;碱性磷酸酶（AKP）试剂盒（批号20171221）、琥珀酸脱氢酶（SDH）试剂盒（批号20171225）、苹果酸脱氢酶（MDH）试剂盒（批号20171225）购自南京建成生物工程研究所;蛋白浓度测定试剂盒（批号20171116）购自北京常莱宝科技有限公司;乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号20180319）购自上海科华生物工程股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：AUW220D电子天平（日本岛津），HVE-50全自动灭菌锅（日本Hirayama），SW-CJ-IFD超净工作台（苏州净化设备有限公司），Forma 3110生化培养箱（美国热电公司），SU80-40扫描电镜（日立），DH-20F台式高速冷冻离心机（长沙市百诺克离心机仪器有限公司），Agilent 8453紫外可见分光光度计（美国安捷伦科技公司），Accuri® C6 Plus流式细胞仪（美国BD公司），CS-2000高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司），xMark酶标仪（美国伯乐BIO-RAD公司）。

1. 2 赪桐提取物制备

将新鲜采摘的赪桐茎叶置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎成粉末。称取500 g赪桐粉末，80%乙醇（料液比1∶10）超声波提取3次，每次1 h，合并滤液，浓缩回收乙醇，得浸膏131.8 g，浸膏以少量纯化水分散悬浮，再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，减压浓缩蒸干溶剂，得到正丁醇相浸膏54.0 g。

1. 3 抑菌圈（IZ）测定

IZ试验采用纸片扩散法，并以无菌水及庆大霉素作为对照。

1. 4 最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定

采用微量肉汤稀释法（郑翠萍等，2015）测定EFC的MIC和MBC，设5次平行试验，以刃天青作为指示剂，无细菌生长的孔呈蓝色，有细菌生长的孔则逐渐由蓝色变成粉色，并设阳性对照组（加菌和加庆大霉素）及阴性对照组（加菌和加无菌水）。

1. 5 细胞膜通透性测定

菌体处理方法：在肉汤培养基中分别加入对数生长期的金黄色葡萄球菌和EFC，使药物终浓度为2.5 mg/mL，另设无菌水为空白对照，于37 ℃下130 r/min摇床培养。取各组培养液2.0 mL，4000 r/min离心10 min，弃沉淀，按试剂盒说明测定各时段培养液上清液中的LDH活性（黎芳靖，2018）;按照钾离子测定试剂盒说明测定各时段培养液上清液中的K+浓度（黄巍等，2017）。

1. 6 细胞壁通透性测定

菌体处理方法同1.5。按照试剂盒说明测定各时段培养液上清液中的AKP活性（刘昊等，2017）。

1. 7 可溶性蛋白含量测定

在肉汤培养基中分别加入对数生长期的金黄色葡萄球菌和EFC，使药物终浓度为0、2.50、5.00和10.00 mg/mL。于37 ℃下130 r/min摇床连续培养24 h，取各组培养液4000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀，测定上清液蛋白含量即胞外可溶性蛋白含量，沉淀用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤3次，再加入蒸馏水5.0 mL，超声波处理20 min后4000 r/min离心10 min，去除沉淀，然后测定上清液蛋白含量即胞内可溶性蛋白含量（李璐等，2016）。蛋白含量参照试剂盒说明进行测定。

1. 8 TCA循环影响测定

菌体处理方法同1.5。参照Li等（2017）的方法收集菌体，然后根据试剂盒说明测定各时段培养液上清液中的SDH和MDH活性。

1. 9 胞内ROS水平测定

菌体处理方法同1.7。取连续培养12 h的各组培养液，参照黄燕飞（2016）的方法收集菌体;再根据试剂盒说明采用流式细胞仪（FCM）测定各样品荧光强度。

1. 10 细胞凋亡测定

菌体处理方法同1.7。取连续培养20 h的各组培养液，参照黄燕飞（2016）的方法收集菌体;再根据试剂盒说明采用FCM测定各样品荧光强度。

1. 11 超微结构分析

菌体处理方法同1.5。取连续培养24 h的各组培养液，参照黄燕飞（2016）的方法收集菌体;再参照王永刚等（2018）的方法制备电镜样品后进行扫描电镜（SEM）观察。

1. 12 生长曲线测定方法

菌体处理方法同1.7。紫外分光光度计（600 nm）测定各组培养液中不同时间点的吸光值。

1. 13 统计分析

采用SPSS 13.0对试验数据进行统计分析，其中组间两两比较采用 t 检验。

2 结果与分析

2. 1 EFC的IZ、MIC及MBC测定结果

由表1可知，EFC对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌（G+）、伤寒沙门菌（G‒）和枯草芽孢杆菌（G+）的IZ分别为19.04、14.85和10.04 mm，MIC分别为0.50、1.25和2.50 mg/mL，MBC分别为1.00、2.50和5.00 mg/mL。EFC对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，因此有必要对其抑菌机制进行深入研究。

2. 2 细胞膜完整性测定结果

细胞膜是金黄色葡萄球菌的保护屏障之一。LDH是一种胞内酶，正常情况下不会外漏，当菌体细胞膜受损时LDH可从胞浆渗出至培养液中，即通过测定培养液中LDH活性的变化可推断细胞膜是否完整。细胞膜通透性发生改变，胞内离子也可穿过细胞膜而外泄，导致培养液中离子浓度增加。由图1和图2可知，与对照组相比，LDH和K+外泄均呈逐渐增加趋势，培养至10 h时LDH、K+外泄分别增加72.0%和43.0%，差异显著（P<0.05，下同）。说明EFC可能具有破坏金黄色葡萄球菌细胞膜完整性的作用，从而导致细菌内容物大量外泄。

2. 3 细胞壁完整性测定结果

培养基上清液AKP活性改变可反映菌体细胞壁通透性的变化，药物处理后菌液AKP活性增加，说明药物可破坏菌体细胞壁，而失去对菌体的保护作用，最终致使细菌溶解死亡。由图3可看出，EFC组培养液中的AKP活性较对照组高，并随着时间的延长而逐渐增强。培养至10 h时AKP活性较对照组增加78.0%，且差异显著。说明EFC可能具有破坏金黄色葡萄球菌细胞壁完整性的作用，从而导致细菌胞AKP大量外泄。

2. 4 可溶性蛋白含量测定结果

由图4可知，金黄色葡萄球菌经EFC作用24 h后，其胞外蛋白含量与对照组相比呈明显的上升趋势，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）组分别上升28.6%、41.8%和61.5%，可能是细菌细胞膜通透性增加導致部分蛋白外漏所致。与对照组相比，胞内蛋白含量呈明显下降趋势，5MIC、10MIC和20MIC组分别下降40.9%、61.3%和82.5%，可能是EFC对金黄色葡萄球菌蛋白具有一定的抑制作用，通过破坏部分蛋白结构而抑制蛋白合成。

2. 5 TCA循环影响测定结果

SDH和MDH是三羧酸循环中的关键调控酶，检测培养液中SDH和MDH的活性能间接反映菌体内能量代谢的情况。由图5和图6可知，EFC组的SDH和MDH活性与对照组相比明显下降，连续培养10 h后SDH和MDH活性分别显著下降80.0%和36.4%。说明EFC能抑制金黄色葡萄球菌的SDH和MDH活性，进而扰乱菌体内能量代谢。

2. 6 胞内ROS水平测定结果

ROS作为细菌新陈代谢的产物在细胞中不断产生和消除，ROS系统失衡会对细胞造成伤害，甚至导致细胞死亡。ROS水平变化在一定程度上可反映细菌细胞内部活性的变化。2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）本身没有荧光，可自由穿过细胞膜，进入胞内后可被细胞内的酯酶水解生成DCFH。DCFH不会通透细胞膜，因此探针极易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能将无荧光的DCFH氧化生成具有荧光的DCF。本研究通过DCFH-DA单染色法，采用FCM检测DCF荧光强度以评价细菌胞内ROS水平。由图7可知，5MIC、10MIC和20MIC组金黄色葡萄球菌的ROS含量与对照组相比分别增加9.1%、33.5%和51.0%，说明EFC可能通过扰乱细菌ROS平衡而达到抑制细菌生长繁殖的作用。

2. 7 细胞凋亡测定结果

细胞凋亡是指细胞在环境条件改变时为了维护内环境稳定而通过基因调控使其自动结束生命的过程。本研究采用Annexin-V/PI复染法检测菌体细胞凋亡，结果（图8）显示，金黄色葡萄球菌经EFC处理后，Annexin V-FITC染色呈阳性且PI染色呈阴性的细胞即凋亡细胞（图右下象限Q4-LR）呈增加趋势;Annexin V-FITC染色和PI染色均呈阳性的细胞即坏死细胞（图右上象限Q4-UR）也有所增加;Annexin V-FITC染色呈阴性而PI染色呈阳性的细胞（图左上象限Q4-UL）则是许可范围内检测误差所在象限。细胞凋亡率=Q4-UR+Q4-LR。由图8可知，5MIC、10MIC和20MIC组的细胞凋亡率与对照组相比分别增加24.0%、50.6%和72.8%，说明EFC的抑菌作用可能与其促使金黄色葡萄球菌发生细胞凋亡及影响菌体系列基因激活、表达和调控有关。

2. 8 菌体超微结构分析结果

对照组金黄色葡萄球菌在扫描电镜下外观饱满、形态规则、表面光滑（图9-A）;而经EFC作用24 h后，扫描电镜下的菌体形态结构不规则、萎缩、畸形（图9-B）。说明EFC具有破坏菌体形态结构的作用，可能与破坏菌体细胞壁、细胞膜及抑制蛋白合成等有关。

2. 9 生长曲线图绘制结果

生长曲线可表征菌体的生长规律，同时反映药物对细菌生长增殖周期的抑制情况。由图10可知，对照组金黄色葡萄球菌培养2 h后开始进入对数生长期，培养22～24 h后进入细菌稳定生长期，培养26 h后进入衰亡期。加入EFC后，金黄色葡萄球菌的生长受到抑制，其生长曲线发生明显改变，未出现快速生长对数期，说明EFC具有抑制金黄色葡萄球菌生长繁殖的作用，其抑菌机理可能与缩短细菌分裂速度有关。

3 讨论

细菌细胞膜通过调节和选择必需养分及代谢产物进出细胞，从而维持内环境的相对稳定和有序运行。K+能维持细胞内外液的渗透压平衡，当细胞膜通透性增大时，K+大量外泄（Cox et al.，2000）。本研究结果显示，经EFC作用后金黄色葡萄球菌的胞内蛋白、LDH和K+均出现外泄，说明EFC具有破坏菌体细胞膜或促使细胞膜通透性增大的作用。AKP存在于细菌细胞壁和细胞膜间，主要参与细菌磷代谢，当细胞壁通透性增大或受损时会发生大量AKP外泄（刘昊等，2017）。本研究结果表明，与对照组相比，经EFC处理后的金黄色葡萄球菌AKP大量外泄，說明EFC具有破坏细胞壁完整性或增大细胞壁通透性的作用。蛋白作为生命活动的物质基础广泛存在于菌体内，在药物作用下菌体蛋白结构受损或合成受抑制，导致部分生物功能消失。经EFC处理的金黄色葡萄球菌胞内蛋白含量明显下降，说明EFC的抑菌机理可能与阻碍菌体某些蛋白合成有关。

TCA循环是机体糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式，也是糖、脂类、蛋白及核酸代谢与转化的枢纽。SDH和MDH是TCA循环的关键酶（Naseri et al.，2016）。本研究结果表明，经EFC处理后金黄色葡萄球菌的MDH和SDH活性较对照组明显降低，说明EFC的抑菌作用与破坏或抑制TCA循环有关。ROS可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏细胞膜结构，造成机体多种损伤和病变，而加速衰老（Elloumi et al.，2017;Vassie et al.，2017）。本研究结果显示，经EFC处理后金黄色葡萄球菌胞内ROS水平与对照组相比明显增加，说明EFC破坏了菌体ROS与抗氧化系统间的平衡。此外，经EFC处理后金黄色葡萄球菌的细胞凋亡率与对照组相比明显上升，说明EFC具有诱导细胞凋亡的作用。

李开泉等（2002）研究发现乌索酸能抑制金色葡萄糖球菌及酵母的生长;赵雁武等（2003）研究证实3，4-二羟基苯甲醛对金黄葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用;孙涛（2013）研究发现七星瓢虫的次生代谢产物对羟基苯乙醇对沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抑菌活性;蔡百祥等（2015）研究表明0.6 mg/mL丁香脂素对油菜菌核病菌的抑制率达36.72%;石丽娟（2015）研究证实反式对羟基肉桂酸对小麦赤霉病菌的半数有效浓度（EC50）为10.80 mg/L;熊丽霞（2016）研究发现对羟基苯甲醛对酿酒酵母表现出较强的抑制作用，且枯草芽孢杆菌和大肠杆菌对对羟基苯甲醛也较敏感;陆俊（2018）研究证实芹菜素是鸭儿芹发挥抗氧化和抗菌活性的主要活性成分;杨光等（2018）研究表明对羟基苯甲酸对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用。根据以上文献推测，张树琳（2018）从赪桐提取分离的化合物马桶花酮、3，4-二羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、丁香脂素和反式对羟基肉桂酸等可能都是赪桐的有效抑菌活性成分。此外，从赪桐中提取获得的乌索酸（田军和孙汉董，1995）和芹菜素（尚冀宁，2010）可能也是抑菌活性成分。赪桐化学成分种类较多，且其单一成分药理活性作用广泛。本研究结果表明，EFC具有较强的抑菌作用，对金色葡萄糖球菌的IZ、MIC、MBC分别为19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL，可能是通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性及通透性，影响蛋白合成，导致TCA循环减慢而发挥作用，但具体抑菌作用机理有待进一步探究。

4 结论

EFC通过破坏黄金色葡萄球菌细胞壁和细胞膜的完整性及通透性，影响蛋白合成，导致TCA循环减慢而发挥抑菌作用。因此，加强EFC抑菌活性成分研究是开发新型、高效、低毒抗病原菌感染药和植物杀菌剂的重要基础。

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（責任编辑 兰宗宝）