黔产苗药对坐叶药材HPLC指纹图谱研究

冯华 刘亮 王祥培 刘顺美

中图分类号 R284 文獻标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）02-0232-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.18

摘 要 目的：建立黔产苗药对坐叶药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：采用HPLC法。色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm，柱温为25 ℃，进样量为15 µL。以芦丁为参照，测定10批贵州不同地区对坐叶药材的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行共有峰指认和相似度评价。结果：10批对坐叶药材的HPLC指纹图谱有12个共有峰，相似度均大于0.90。经验证，10批样品HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。结论：本研究所建HPLC指纹图谱可为对坐叶药材的鉴别和质量评价提供参考。

关键词 黔产苗药；对坐叶；高效液相色谱法；指纹图谱

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Miao medicine Hedyotis uncinella from Guizhou. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 15 µL. Using rutin as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of H. uncinella from different areas of Guizhou province were determined. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprints （2004A edition） was used to identify common peaks and evaluate similarity. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of H. uncinella， and the similarity was higher than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample were in agreement with control fingerprints. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprints can provide reference for the identification and quality evaluation of H. uncinella.

KEYWORDS Miao medicine from Guizhou； Hedyotis uncinella； HPLC； Fingerprint

苗药对坐叶为茜草科植物对坐叶（Hedyotis uncinella Hook. et Arn.）的干燥全草，为贵州苗药。对坐叶味辛、微苦，性平，具有清热解毒、调中止泻的功效，可用于治疗腹泻、腹胀、腹痛、里急后重以及痢疾、急性胃炎。苗药解毒止泻胶囊，由苗药对坐叶为主药组成中药复方制剂。目前该产品主要在遵义家诚药业生产，苗药解毒止泻胶囊用于胃肠湿热所致的腹泻、腹胀、腹痛、急性肠炎等症状，作为地方药材标准被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）[1]。现行标准仅通过性状、显微、薄层对对坐叶药材进行质量控制。本文对对坐叶药材进行高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究，并对10批不同产地来源对坐叶药材进行了相似度评价比较，建立HPLC指纹图共有模式，以期为对坐叶药材的质量控制和有效识别提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-1260型HPLC仪，包括四元泵、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、Agilent 1260工作站（美国Agilent 公司）；AB204-S型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DV型数控超声波清洗机（功率：500 W，频率：60 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；111型中药粉碎机（上海海久中药机械制造有限公司）。

1.2 药材、药品与试剂

对坐叶药材采集于贵州各地区，经遵义医药高等专科学校刘亮副教授鉴定为茜草科植物对坐叶（Hedyotis uncinella Hook.et Arn.）的干燥全草。药材来源及信息见表1。芦丁对照品（批号：100080-200707，纯度：100%，购于中国食品药品检定研究院）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%A→10%A；5～15 min，10%A→15%A；15～25 min，15%A→20%A；25～35 min，20%A→30%A；35～40 min，30%A→5%A；40～45 min，5%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：235 nm；进样量为15 μL；运行时间：45 min[2-6]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取对坐叶药材粉末（过3号筛）约1.0 g，置于锥形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理60 min，取出，放置至室温，再次称定质量，用甲醇补足质量，过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取供试品溶液（编号：S4）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以14号峰芦丁为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对保留峰面积的RSD分别为1.5%和2.1%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取供试品溶液（编号：S4）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以14号峰芦丁为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对保留峰面积的RSD分别为1.4%和2.0%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品（编号：S4）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以14号峰芦丁为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对保留峰面积的RSD分别为1.7%和2.3%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关数据分析

2.4.1 HPLC指纹图谱生成 取10批对坐叶药材各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对10批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1～图3。

2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行相似度评价结果显示，10批对坐叶药材样品的相似度均大于0.90，且与对照指纹图谱具有较好的一致性，表明药材样品间差异较小，质量稳定性良好，详见表2～表4。

2.4.3 HPLC指纹图谱相关分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），对10批药材样品的HPLC指纹图谱进行比较分析。结果显示，10批药材样品有12个共有峰，其中14号峰（芦丁）峰面积大，且为所有药材样品共有，确定其为参照峰。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用HPLC仪的二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内进行扫描，以确定样品的吸收波长。结果，在225、235 、254 nm波长处吸收较强。采用多波长进样分析，结果在235 nm波长下所得基线较稳定、色谱峰较多、信息丰富，故选择235 nm为检测波长。

3.2 提取方法的选择

以甲醇为提取溶剂，分别考察超声提取、回流提取、浸渍提取这3种提取方法。分别进样后，从色谱图信息分析，3种提取法制备的供试品溶液图谱信息未见明显差异。综合考虑，选定操作更简便的超声提取方法来制备供试品溶液。

3.3 流动相的选择

在对供试品溶液进行HPLC分析时，本课题组分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等流动相体系对色谱分离过程的影响[3-6]。结果显示，乙腈-0.20%磷酸溶液的分离度高，峰形对称，基线稳定。

3.4 梯度洗脱的时间确定

以乙腈-0.20%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，分别考察了样品在40、50、60、70 min洗脱时间的色谱图[7]。结果显示，45 min后图谱基线稳定，无其他峰出现，故选择梯度洗脱时间为45 min为宜。

3.5 产地的选择

通过查询全国中草药资源普查信息和课题组成员到贵州各地区药材采集信息情况，发现对坐叶药材主要分布在贵州安顺、黔东南州、黔南州、铜仁地区。由于药材生长受环境、气候、地理条件等影响，以及指纹图谱研究要求样本应在10批次以上，所以本试验研究采集样品10批，其中有2批是在同一个县不同乡镇采集。

3.6 参照峰的选择

对坐叶药材主要成分为黄酮类[8-10]，而黄酮类主要包括槲皮素、熊果酸、木犀草素、芦丁。通过色谱定位，14号峰为芦丁，其峰面积大，且为所有药材样品共有，故确定其为参照峰。

3.7 指纹图谱分析

通过建立该指纹图谱，对10批对坐叶药材HPLC图谱进行比较，结果发现药材HPLC图谱的共有峰保留时间、相对峰面积非常吻合，与共有模式R比较，相似度均大于0.90。从各峰面积大小来看，峰面积有很大的差异，可能与药材生长环境有关。从共有峰可以确定10批对坐叶药材有效成分具有一致性。

综上，本研究所建HPLC指纹图谱可为对坐叶药材的鉴别和质量评价提供参考。

参考文献

[ 1 ] 贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准：2003年版[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：149.

[ 2 ] 周建良，齐炼文，李萍.色谱指纹图谱在中药质量控制中的应用[J].色谱，2008，26（2）：153-159.

[ 3 ] 冯华，邓丽娟，吴林菁，等.酢浆草高效液相色谱指纹图谱的鉴别研究[J].时珍国医国药，2014，25（10）：2414-2416.

[ 4 ] 冯华，聂明华，罗秀琼，等.土知母药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（6）：67-69.

[ 5 ] 冯华，石尚友，罗秀琼，等.黔产见血清药材薄层色谱与HPLC指紋图谱识别[J].时珍国医国药，2017，28（10）：2423-2425.

[ 6 ] 冯华，石尚友，罗秀琼，等.黔产大菟丝子药材高效液相色谱指纹图谱的鉴别研究[J].时珍国医国药，2017，28（3）：634-635.

[ 7 ] 冯华，杨烨，王祥培，等.艾纳香及其伪品假东风草的HPLC指纹图谱研究[J].中国药房，2017，28（9）：1257-1261.

[ 8 ] 刘亚华，徐君，李齐激，等.对坐叶化学成分研究[J].中成药，2013，35（3）：556-559.

[ 9 ] 徐君，吴连花，徐文芬，等.HPLC法测定对坐叶中齐墩果酸和熊果酸[J].中成药，2012，34（4）：765-767.

[10] 陈华国，靳凤云，赵超，等.HPLC法测定对坐叶中木犀草素的含量[J].中国药房，2009，20（36）：2838-2839.

（收稿日期：2018-02-24 修回日期：2018-11-08）

（编辑：余庆华）