敲低IncRNA`-CCAT1表达对胶质瘤细胞凋亡影响

刘柳　蒋超　王舒阳

[摘要]目的探讨敲低长链非编码RNA`-结肠癌相关转录因子1（IncRNA`-CCAT1）表达对胶质瘤细胞活力、凋亡的影响及机制。方法将人脑胶质瘤U251细胞随机分为空白组（未转染的细胞）、阴性对照IncRNA`-CCAT1`-NC组（NC组）和IncRNA`-CCAT1`-小干扰RNA（siRNA）组（CCAT1`-siRNA组），CCAT1`-siRNA转染U251细胞48 h，应用实时荧光定量PCR（qRT`-PCR）、流式细胞术及Western blotting分别检测转染效果、细胞凋亡率及β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表达。采用MTT法检测CCAT1`-siRNA转染U251细胞24～96 h的细胞活力。结果CCAT1`-siRNA组和空白组间CCAT1 mRNA表达差异具有统计学意义（F=472.885，P<0.05），而NC组和空白组间CCAT1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。CCAT1`-siRNA组和空白组相比较，细胞活力降低，凋亡率升高，β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表达降低，差异具有统计学意义（F=13.372～100.869，P<0.05）。结论敲低IncRNA`-CCAT1表达可抑制胶质瘤细胞活力、诱导凋亡，其机制可能与下调Wnt/β`-catenin信号通路β`-catenin、cyclinD1和Survivin表达有关。

[关键词]神经胶质瘤;RNA，长链非编码;结肠癌相关转录因子1;细胞凋亡;Wnt信號通路

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of knockdown of the long non`-coding RNA colon cancer`-associated transcript 1 （lncRNA`-CCAT1） on the viability and apoptosis of glioma cells and related mechanism. MethodsHuman glioma U251 cells were randomly divided into blank group （untransfected cells）， lncRNA`-CCAT1 negative control group （NC group）， and lncRNA`-CCAT1 small interfering RNA group （CCAT1`-siRNA group）. U251 cells were transfected with CCAT1`-siRNA for 48 h. Quantitative real`-time PCR was used to measure transfection efficiency， flow cytometry was used to measure cell apoptosis rate， and Western blot was used to measure the protein expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin. MTT assay was used to measure the viability of U251 cells at 24-96 h of CCAT1`-siRNA transfection. ResultsThere was a significant difference in the mRNA expression of CCAT1 between the CCAT1`-siRNA group and the blank group （F=472.885，P<0.05）， while there was no significant difference between the NC group and the blank group （P>0.05）. Compared with the blank group， the CCAT1`-siRNA group had a significant reduction in cell viability， a significant increase in apoptosis rate， and significant reductions in the protein expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin （F=13.372-100.869，P<0.05）. ConclusionLncRNA`-CCAT1 knockdown can inhi`-bit the viability and induce apoptosis of glioma cells， possibly by downregulating the expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin in the Wnt/β`-catenin signaling pathway.

[KEY WORDS]glioma; RNA， long noncoding; colon cancer associated transcription 1; apoptosis; Wnt signaling pathway

脑胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤，具有发病率高、复发率高、死亡率高及治愈率低的特点，严重危害人民的生命健康[1]。随着分子生物学及肿瘤基因学的发展，胶质瘤的基因治疗成为研究热点。长链非编码RNA（IncRNA）是一类不编码蛋白、转录后长度大于200 nt的RNA分子，具有类似mRNA样结构。近些年大量研究结果表明，IncRNA与多种疾病发生发展密切相关[2`-3]。结肠癌相关转录因子1（CCAT1）是新近发现的一种IncRNA，在肝癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤中IncRNA`-CCAT1均呈现高表达，影响肿瘤发生发展[4`-6]。胶质瘤相关研究结果显示，IncRNA`-CCAT1可促进胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移和上皮细胞`-间充质转化（EMT）[7`-8]。但关于其对胶质瘤细胞凋亡的影响及机制目前尚未清楚。因此，本研究以人脑胶质瘤U251细胞为研究对象，通过RNA干扰技术抑制CCAT1表达，旨在探讨敲减IncRNA`-CCAT1表达对脑胶质瘤细胞凋亡影响，并进一步研究影响凋亡的作用机制。现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1细胞系及试剂和仪器

人脑胶质瘤U251细胞系购自中国科学院上海细胞库。RPMI 1640培养液、FBS均购自美国Gibco;IncRNA`-CCAT1`-阴性对照（NC）和IncRNA`-CCAT1`-小干扰RNA（siRNA）均由广州瑞博生物科技有限公司合成;噻唑蓝（MTT）试剂盒及DMSO均购自美国Sigma;β`-catenin、cyclinD1和Survivin抗体及HRP标记的二抗均购自美国Abcam;细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD;多功能酶标仪购自美国Bio`-Rad;实时荧光定量PCR（qRT`-PCR）试剂盒购自大连TaKaRa。

1.2细胞培养

U251细胞常规复苏后，使用含体积分数0.10 FBS的RPMI 1640培养液，在体积分数0.05 CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，每天观察细胞生长状态，每2 d换液1次，细胞生长状态良好，且达90%～95%融合时，按照实验需要传代。取生长至对数期的细胞进行后续实验。

1.3分组及转染

将U251细胞随机分为空白组（未转染的细胞，A组）、阴性对照IncRNA`-CCAT1`-NC组（NC组，B组）和IncRNA`-CCAT1`-siRNA组（CCAT1`-siRNA组，C组）。转染的操作步骤按照LipofectamineTM 2000说明进行。转染前1 d以生长至对数期的U251细胞接种于6孔板，密度为（3～5）×107/L，使转染前细胞达30%～50%融合。制备脂质体和siRNA复合物，将复合物加入6孔板，于体积分数0.05 CO2、37 ℃恒温培养箱中培养6 h，更换含血清的培养液继续培养48 h，用于后续实验研究。

1.4qRT`-PCR方法验证敲低U251细胞IncRNA`-CCAT1效率

采用Trizol法提取转染CCAT1`-siRNA 48 h细胞总RNA，紫外线分光光度计检测A260/280比值及浓度，比值为1.8～2.0时，表明样品纯度高，可用于后续实验。依据大连TaKaRa逆转录试剂盒说明要求将总RNA逆转录为cDNA。参照qRT`-PCR试剂盒说明配置反应体系及设置反应条件，其中反应体系为20 μL，反应结束后，依据所得Ct均值，以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct方法计算各组细胞IncRNA`-CCAT1的mRNA相对表达量。每组实验均重复3次，取均值。

1.5MTT法测定细胞活力

以每孔5 000个生长至对数期的U251细胞接种于96孔板，常规培养24 h后，按照1.3方法转染，每组设置5个重复孔，转染后的细胞在体积分数0.05 CO2、37 ℃恒温培养箱培养24、48、72和96 h，吸去孔内培养液，PBS洗涤1次，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），常规孵育4～6 h，吸尽孔内上清，每孔加DMSO 150 μL，摇床低速震荡10 min。于490 nm波长处用酶标仪测定各孔的吸光度（A）值。实验重复3次，取均值。

1.6流式细胞术测定细胞凋亡率

以每孔5×105个生长至对数期的U251细胞接种于96孔板，参照1.3方法将CCAT1`-siRNA转染细胞，预冷PBS洗涤、1×binding buffer重悬转染48 h的细胞，取200 μL细胞悬液，分别加5 μL 的Annexin V`-FITC和5 μL的 PI，上机前补加1×binding buffer 200 μL，通过流式细胞仪检测（1 h内完成）。实验重复3次。

1.7Western blotting检测相关蛋白表达

采用RIPA裂解液提取敲低IncRNA`-CCAT1`-siRNA的U251细胞、阴性对照U251细胞及未转染的空白组U251细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。总蛋白100 ℃水浴变性5 min，按照每孔40 μg上样，依次经100 g/L SDS`-PAGE电泳、转膜及封闭膜后，TBST洗膜，将膜置于使用封闭液稀释的一抗溶液中（1∶1 000稀释的β`-catenin、cyclinD1和Survivin抗体及1∶2 000稀释的内参GAPDH），4 ℃孵育过夜，次日，TBST洗膜，加HRP标记的二抗（1∶2 000稀释），37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。使用Image J2x软件对相应蛋白进行光密度分析。实验重复3次。

1.8统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK`-q检验。

2结果

2.1敲低IncRNA`-CCAT1对CCAT1 mRNA表达影响

本文qRT`-PCR检测结果表明，空白组、NC组和CCAT1`-siRNA组的CCAT1 mRNA表达量分别为1.000、0.974±0.048和0.302±0.026，CCAT1`-

2期刘柳，等. 敲低IncRNA`-CCAT1表达对胶质瘤细胞凋亡影响199

siRNA組CCAT1 mRNA表达较NC组和空白组明显降低，差异均具有显著意义（F=472.885， P<0.05），而NC组和空白组间CCAT1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2敲低IncRNA`-CCAT1表达对U251细胞活力影响

MTT检测的各组细胞活力结果显示，NC组和空白组在CCAT1`-siRNA转染U251细胞24～96 h的细胞活力差异均无统计学意义（P>0.05），而CCAT1`-siRNA组从转染48 h起细胞活力明显低于空白组（F=10.415～23.775，P<0.05）。见图1。

2.3敲低IncRNA`-CCAT1表达对U251细胞凋亡影响

流式细胞术检测结果显示，空白组、NC组和CCAT1`-siRNA组的细胞凋亡率分别为（3.66±0.32）%、（3.47±0.30）%和（24.48±2.03）% CCAT1`-siRNA组细胞凋亡率较NC组和空白组明显升高，差异有显著意义（F=304.267，P<0.05）。见图2。

2.4敲低IncRNA`-CCAT1表达对Wnt/β`-catenin信号通路蛋白表达影响

Western blotting检测各组细胞的β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表达结果显示，CCAT1`-siRNA组β`-catenin、cyclinD1和Survivin的蛋白表达均明显降低（F=13.372～100.869，P<0.05）。见图3、表1。

3讨论

越来越多的研究证实，肿瘤发生的分子机制不仅与蛋白编码基因有关，与非编码调节的RNA也有关系[9`-12]。近年大量的研究表明，人类基因组中有超过90%的LncRNA、siRNA、miRNA等非编码RNA广泛参与肿瘤发生、细胞代谢、免疫应答、胚胎发育等生理病理过程的调控[13`-15]。最近已发现多个LncRNA在胶质瘤中异常表达，且一些LncRNA可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学特性[16]。CCAT1是近年来新发现的一种IncRNA，IncRNA`-CCAT1定位于染色体8q24.21，有多项研究表明IncRNA`-CCAT1可影响肿瘤进展[17`-19]。如IncRNA`-CCAT1可以通过抑制miR`-152促进肝外胆管癌的转移、侵袭和EMT[17];LncRNA`-CCAT1可以通过上调Livin抑制肾癌细胞的凋亡[18];下调IncRNA`-CCAT1可通过调控miR`-148b增强乳癌化疗敏感性[19]。以上研究提示，IncRNA`-CCAT1可能在胶质瘤发生发展中发挥重要作用。已有研究证实，IncRNA`-CCAT1可以促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[8]，而CCAT1对胶质瘤细胞凋亡的影响及其机制目前尚未明确。因此，本研究探讨了敲减IncRNA`-CCAT1表达后的胶质瘤细胞凋亡变化，结果显示，IncRNA`-CCAT1表达降低可明显抑制胶质瘤细胞活力、诱导细胞凋亡。

Wnt/β`-catenin信号通路也被称为经典的Wnt信号，已被证实广泛参与肿瘤形成、胚胎发育、细胞增殖等过程[20`-23]。β`-catenin是Wnt/β`-catenin信号通路的关键信号转导分子，但各种因素引起Wnt分子表达增多时，可使胞质β`-catenin蛋白大量积聚，积聚的β`-catenin入核后与TCF/LEF家族转录因子结合，调控下游cyclinD1、survivin、c`-myc等一系列基因表达，进而影响肿瘤生物学特性[24`-26]。大量研究表明，Wnt/β`-catenin信号异常活化与多种肿瘤发生发展存在密切关系[27`-28]。如过表达SOX9可以通过Wnt/β`-catenin信号通路促进胶质瘤转移[27];Wnt/β`-catenin信号通路抑制剂能够抑制脑胶质瘤细胞增殖、迁徙及迁移能力[28]。此外，也有多項研究表明，IncRNA可通过调控Wnt/β`-catenin信号通路影响胶质瘤细胞生长[29`-30]。如IncRNA AB073614可通过下调SOX7激活Wnt/β`-catenin信号增加胶质瘤的恶性行为[29];高表达LncRNA CCND2`-AS1可通过Wnt/β`-catenin信号通路促进胶质瘤细胞增殖[30]。IncRNA`-CCAT1是否可通过调控Wnt/β`-catenin信号通路影响胶质瘤细胞凋亡还未清楚。本研究结果显示，敲减IncRNA`-CCAT1表达可下调β`-catenin、cyclinD1和survivin表达。这提示IncRNA`-CCAT1诱导胶质瘤细胞凋亡与下调Wnt/β`-catenin信号通路有关。

综上所述，敲减IncRNA`-CCAT1表达可抑制胶质瘤细胞活力、诱导细胞凋亡，其机制与下调Wnt/β`-catenin信号通路有关。目前关于IncRNA`-CCAT1对胶质瘤细胞生长的影响及机制研究较少，本研究也仅限于IncRNA`-CCAT1对胶质瘤细胞增殖、凋亡及Wnt/β`-catenin信号通路的影响，而IncRNA`-CCAT1对胶质瘤细胞凋亡影响是否通过其他信号途径还未明确，值得进一步研究。

[参考文献]

[1]SONG Hang， ZHANG Yao， LIU Na， et al. miR`-92b regulates glioma cells proliferation， migration， invasion， and apoptosis via PTEN/Akt signaling pathway[J]. Journal of Physio`-logy and Biochemistry， 2016，72（2）：201`-211.

[2]ZHANG Daming， LIN Zhaoyu， YANG Zhaohui， et al. IncRNA H19 promotes tongue squamous cell carcinoma progression through beta`-catenin/GSK3 beta/EMT signaling via association with EZH2[J]. American Journal of Translational Research， 2017，9（7）：3474`-3486.

[3]LI Y， WANG Y， WANG H， et al. Effects of lncRNA RP11`-770J1.3 and TMEM25 expression on paclitaxel resistance in human breast cancer cells [J]. Journal of Zhejiang University， 2017，46（4）：364`-370.

[4]孫伟鹏，聂常富，韩风，等. 长链非编码RNA CCAT1在肝细胞癌组织及细胞株中的表达及临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志， 2016，21（4）：325`-328.

[5]CHEN Jing， ZHANG Kai， SONG Haizhu， et al. Long noncoding RNA CCAT1 acts as an oncogene and promotes chemoresistance in docetaxel`-resistant lung adenocarcinoma cells[J]. Oncotarget， 2016，7（38）：62474`-62489.

[6]SHAN T， CHEN Y G， HONG B， et al. Expression and clinical significance of long non`-coding RNA CCAT1 in gastric cancer[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi， 2017，97（18）：1411`-1414.

[7]WANG Zhaohui， GUO Xiaqing， ZHANG Qishun， et al. Long non`-coding RNA CCAT1 promotes glioma cell proliferation via inhibiting microRNA`-410[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2016，480（4）：715`-720.

[8]CUI Bingzhou， LI Baoshan， LIU Qi， et al. lncRNA CCAT1 promotes glioma tumorigenesis by sponging miR`-181b[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2017，118（12）：4548`-4557.

[9]XIANG Jianfeng， YIN Qingfei， CHEN Tian， et al. Human colorectal cancer`-specific CCAT1`-L lncRNA regulates long`-range chromatin interactions at the MYC locus[J]. Cell Research， 2014，24（5）：513`-531.

[10]YANG Huan， WANG Shuang， KANG Yujun， et al. Long non`-coding RNA SNHG1 predicts a poor prognosis and promotes colon cancer tumorigenesis[J]. Oncology Reports， 2018，40（1）：261`-271.

[11]LIN Yuxiang， GUO Wenhui， LI Neng， et al. Polymorphisms of long non`-coding RNA HOTAIR with breast cancer susceptibility and clinical outcomes for a southeast Chinese Han population[J]. Oncotarget， 2018，9（3）：3677`-3689.

[12]WANG Jianguo， SHI Chunyun， WANG Jianfei， et al. MicroRNA`-320a is downregulated in non`-small cell lung cancer and suppresses tumor cell growth and invasion by directly targeting insulin`-like growth factor 1 receptor[J]. Oncology Letters， 2017，13（5）：3247`-3252.

[13]HU Baoli， ZHANG Haifeng， WANG Zuopei， et al. LncRNA CCAT1/miR`-130a`-3p axis increases cisplatin resistance in non`-small`-cell lung cancer cell line by targeting SOX4[J]. Cancer Biology & Therapy， 2017，18（12）：974`-983.

[14]WEI Guanyun， SUN Lianjie， LI Ruimin， et al. Dynamic miRNA`-mRNA regulations are essential for maintaining Drosophila immune homeostasis during Micrococcus luteus infection[J]. Developmental & Comparative Immunology， 2018，81（1）：210`-224.

[15]TIAN Fei， JIA Ligang， CHU Zhaoping， et al. MicroRNA`-519a inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of ovarian cancer cells through targeting signal transducer and activator of transcription 3[J]. Experimental & Therapeutic Me`-dicine， 2018，15（2）：1819`-1824.

[16]NIE Wei， GE Huijuan， YANG Xiaoqun， et al. LncRNA`-UCA1 exerts oncogenic functions in non`-small cell lung cancer by targeting miR`-193a`-3p[J]. Cancer Letters， 2016，371（1）：99`-106.

[17]ZHANG Shouhua， XIAO Juhua， CHAI Yong， et al. IncRNA`-CCAT1 promotes migration， invasion， and EMT in intrahepatic cholangiocarcinoma through suppressing miR`-152[J]. Digestive Diseases and Sciences， 2017，62（11）：3050`-3058.

[18]CHEN Shaoan， MA Pengpeng， LI Bin， et al. LncRNA CCAT1 inhibits cell apoptosis of renal cell carcinoma through up`-regulation of Livin protein[J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2017，434（1/2）：135`-142.

[19]LAI Y， CHEN Y， LIN Y， et al. Down`-regulation of LncRNA CCAT1 enhances radiosensitivity via regulating miR`-148b in breast cancer[J]. Cell Biology International， 2017，42（2）：227`-236.

[20]ZHANG Zheying， ZHOU Chang， CHANG Yaya， et al. Long non`-coding RNA CASC11 interacts with hnRNP`-K and activates the WNT/β`-catenin pathway to promote growth and metastasis in colorectal cancer[J]. Cancer Letters， 2016，376（1）：62`-73.

[21]WANG Wei， LI Qing， YANG Tao， et al. Anti`-cancer effect of Aquaporin 5 silencing in colorectal cancer cells in association with inhibition of Wnt/β`-catenin pathway[J]. Cytotechnology， 2018，70（2）：1`-10.

[22]XU Weiran， HE Liang， LI Ying， et al. Silencing of lncRNA ZFAS1 inhibits malignancies by blocking Wnt/β`-catenin signaling in gastric cancer cells[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry， 2018，82（138）：1`-10.

[23]WU Kefeng， LIANG WeiCheng， FENG Lu， et al. H19 me`-diates methotrexate resistance in colorectal cancer through activating Wnt/β`-catenin pathway.[J]. Experimental Cell Research， 2017，350（2）：312`-317.

[24]WANG Tao， LIU Zi， SHI Fan， et al. Pin1 modulates chemo`-resistance by up`-regulating FoxM1 and the involvements of Wnt/beta`-catenin signaling pathway in cervical cancer[J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2016，413（1/2）：179`-187.

[25]WU Fang， LI Jun， GUO Ni， et al. MiRNA`-27a promotes the proliferation and invasion of human gastric cancer MGC803 cells by targeting SFRP1 via Wnt/β`-catenin signaling pathway[J]. American Journal of Cancer Research， 2017，7（3）：405`-416.

[26]ZHANG Jinghua， JIAO Liyan， LI Tiejun， et al. GSK`-3β suppresses HCC cell dissociationin vitroby upregulating epithelial junction proteins and inhibiting Wnt/β`-catenin signaling pathway[J]. Journal of Cancer， 2017，8（9）：1598`-1608.

[27]LIU Hongwei， LIU Zhixiong， JIANG Bing， et al. SOX9 overexpression promotes glioma metastasis via Wnt/beta`-Catenin signaling[J]. Cell Biochemistry and Biophysics， 2015，73（1）：205`-212.

[28]趙贤军，康暐，袁国强，等. Wnt/β`-catenin信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞迁移的影响[J]. 中国老年学杂志， 2017，37（18）：4474`-4476.

[29]LI Y， GANG Z， WEN Z， et al. Long noncoding RNA AB073614 promotes the malignance of glioma by activating Wnt/β`-catenin signaling through downregulating SOX7[J]. Oncotarget， 2017，8（39）：65577`-65587.

[30]ZHANG Hua， WEI Dailin， WAN Long， et al. Highly expressed lncRNA CCND2`-AS1 promotes glioma cell proliferation through Wnt/beta`-catenin signaling[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017，482（4）：1219`-1225.