海南省角膜营养不良患者TGFBI基因型-表型关系的研究

唐平，王玲通讯作者，陈执，吕博琦，李蒙恩

（1. 海南医学院第一附属医院眼科，海南 海口 570102；2. 海南国爱近视治疗中心，海南 海口 570208）

角膜营养不良（corneal dystrophy）是一组以角膜组织出现形态、性质各异沉积物为主要病理特征，以角膜糜烂、角膜白斑、视力严重下降等为主要表现的遗传性、对称性、非炎症性角膜疾病的总称，不仅影响患者的生活质量、美观，也给社会带来沉重负担。目前，临床研究报道已证实，角膜营养不良与TGFBI基因突变有关[1]，本课题收集海南省各地市医院门诊及眼科收治的不同类型的角膜营养不良患者为研究对象，通过临床、遗传学分析及基因突变检测等方法，在分析膜营养不良患者TGFBI基因突变特点的基础上，研究患者TGFBI基因型-表型的关系，以期了解海南地区角膜营养不良患者TGFBI基因突变热点，并寻找是否有新的突变位点，为角膜营养不良患者基因突变机制的研究提供参考信息。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集海南省各地市医院门诊及眼科收治的不同类型的角膜营养不良患者36例为研究组，患者均为汉族。男20例，女16例；年龄16岁-44岁，平均（31.41±3.55）岁；有明确家族史者26例，无明确家族史者10例。另选择同期于医院门诊就诊的40例排除角膜营养不良的健康者为对照组，健康者均为汉族，男28例，女12例；年龄16岁-44岁，平均（30.56±3.12）岁。予以两组对象一般病历资料包括性别、年龄等比较，均无统计学意义上的差异（P＞0.05），具有可比性。同时，所有研究对象均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床检查 予以两组对象眼科详细检查，包括体格检查、最佳矫正视力（BCVA）检查、裂隙灯显微镜检查、共焦显微镜检查。用裂隙灯图像采集系统记录患者眼前节情况，测量眼压、屈光度。

1.2.2 TGFBI基因突变分析 首先，采集两组对象外周血标本，对白细胞基因组DNA进行提取，提取试剂盒采用威格拉斯全血基因组DNA提取试剂盒。然后，根据TGFBI基因已知突变热点，直接选择TGFBI基因上的第4、11、12、14外显子予以测序。最后，测序结果阳性者予以记录，测序结果阴性者在对剩余12个外显子予以继续测序。外显子引物由上海美吉生物医药科技有限公司提供，引物序列及扩增条件严格按照引物说明书进行，纯化扩增产物后行DNA双向测序。通过对测序结果的记录，将其与Genebank收录的TGFBI基因予以比较，分析两组对象TGFBI基因突变情况，并总结特点[2]。

1.3 观察指标

1.3.1 研究组和对照组对象TGFBI基因突变情况 根据1.2.2 TGFBI基因突变检测结果，总结并比较研究组和对照组对象TGFBI基因突变特点。

1.3.2 研究组患者TGFBI基因型-表型的关系 对研究组36例患者资料按Kannabiran分类标准进行诊断及分型，并做出遗传学表型认定，包括Avellino角膜营养不良（ACD）型，格子状角膜营养不良（LCD）型，Thiel.Behnke角膜营养不良（TBCD）型，Reis-Bueklers角膜营养不良（RBCD）型，颗粒状角膜营养不良（GCD）型[3]。对比分析各种表型患者TGFBI基因突变特点。

1.4 统计学方法 统计软件采用SPSS 20.0版本，以［n（%）］的形式对计数检测数据进行表示，数据之间的比较用χ2对其进行检验，P＜0.05即提示有统计学意义上的差异。

2 结果

2.1 研究组和对照组对象TGFBI基因突变特点分析 TGFBI基因突变发生率：研究组36例患者中所有患者均发生TGFBI基因突变，TGFBI基因突变发生率为100%（36/36）；对照组40例健康者均未发生TGFBI基因突变，TGFBI基因突变发生率为0。两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

研究组患者TGFBI基因突变特点：（1）突变形式。研究组36例患者检测出的TGFBI基因突变均为杂合错义突变，突变类型共9种，包括临床已报道的8种常规突变形式：c.370C＞T（p.R124C）、c.371G＞A（p.R124H）、c.371G＞T（p.R124L）、c.1514T＞A（p.V505D）、c.1663C＞T（p.R555W）、c.1664G＞A（p.R555Q）、c.1859C＞A（p.A620D）、c.1877A＞G（p.H626R），和新发现的突变形式：c.1694T＞A（p.L565H）。其中，c.371G＞A（p.R124H）突变形式的发生率最高，为66.67%（24/36），显著高于其他突变形式（P＜0.05）。（2）突变位点。经检测及统计所得，研究组36例患者TGFBI基因第4号外显子突变频率最高，为80.56%（29/36），显著高于其他位点（P＜0.05）。

2.2 研究组患者TGFBI基因型-表型的关系 从表1可以看出，研究组36例患者各TGFBI基因表型对应不同的基因突变形式，存在表型异质性；ACD表型分布率最高，为66.67%（24/36）；新发现的TGFBI基因突变形式的表型为LCD。

表1 研究组患者TGFBI基因型-表型的关系分析（n=36）

3 讨论

目前国内外报道与角膜营养不良（corneal dystrophy）相关的基因很多，但TGFBI基因是第一个被发现也是目前报道最为常见的相关基因[4]。在TGFBI基因突变发生率上，本研究结果显示研究组患者为100%，对照组健康者为0，两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），即角膜营养不良患者均存在TGFBI基因突变。 而自1997年Munier研究报道证实TGFBI为角膜营养不良的致病基因后，关于角膜营养不良患者TGFBI基因突变形式及位点的研究不断有新的突破[5]。而TGFBI基因突变的方式和位点是决定角膜营养不良患者沉积物具体种类、特点及对视力损伤程度的关键因素。因此，在已有报道的基础上，研究角膜不良患者TGFBI基因突变新的形式仍是临床医学工作者探讨的热点。本研究中，研究组36例患者检测出的TGFBI基因突变类型共9种，包括临床已报道的8种常规突变形式和新发现的突变形式：c.1694T＞A（p.L565H）。许可等在其研究报道中，同样发现c.1694T＞A（p.L565H）为角膜营养不良患者TGFBI基因突变新的形式，该新型突变形式的发现对拓展角膜营养不良患者TGFBI基因突变谱，开拓角膜营养不良基因病变机制研究思路具有重要的意义[6,7]。同时，本研究中c.371G＞A（p.R124H）突变形式的发生率显著高于其他突变形式（P＜0.05），即c.371G＞A（p.R124H）为角膜营养不良患者TGFBI基因突变的主要形式，该结果与临床研究报道一致[8]。在突变位点上，本研究结果显示，TGFBI基因第4号外显子突变频率最高，为80.56%（29/36），显著高于其他位点（P＜0.05），同样与临床研究报道一致[9]。

在角膜营养不良患者TGFBI基因表型上，不同表型患者角膜混浊特征相似度极高，区分难度非常大。而近年来在基因检测技术发展进程的不断推进下，针对临床上难以确诊表型的角膜营养不良患者可通过分子遗传学方法予以分类诊断[10]。本研究对研究组36例患者资料按Kannabiran分类标准进行诊断及分型，并做出遗传学表型认定，进而予以患者各TGFBI基因表型的诊断。在角膜营养不良患者TGFBI基因型-表型的关系上，本研究结果显示，研究组患者各TGFBI基因表型对应不同的基因突变形式，提示角膜营养不良患者TGFBI基因存在表型异质性，即在不同家系中可对同一基因的不同等位基因突变体进行遗传，最终出现不同的表型[11]。与此同时，本研究中患者ACD表型分布率最高，为66.67%（24/36），即ACD表型为角膜营养不良患者最常见的基因表型。另外，新发现的TGFBI基因突变形式的表型为LCD，可为后期TGFBI基因突变形式的研究提供新的思路[12]。

综上，通过对海南省各地市医院门诊及眼科收治的不同类型的角膜营养不良患者TGFBI基因突变的分析，得出c.1694T＞A（p.L565H）为海南省角膜营养不良患者新发TGFBI基因突变形式，c.371G＞A（p.R124H）为主要突变形式，第4号外显子突变频率最高，TGFBI基因存在表型异质性。